Name: generation of car t cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.

इस प्रोटोकॉल 10 चूहों 10 7 कार टी कोशिकाओं से प्रत्येक के साथ व्यवहार कर रहे हैं, जहां एक प्रयोगात्मक डिजाइन पर आधारित है। यह 10 8 कार टी कोशिकाओं की जरूरत होगी कि इसका मतलब है; उपज व्यवहार्यता में नुक...

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	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sipuleucel-T+immunotherapy+for+castration-resistant+prostate+cancer.">Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer.</a> N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).</li><li>Hodi, F. 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यहाँ वर्णित उपचार समय की देखभाल के नैदानिक ​​मानक मॉडल और कार दत्तक चिकित्सा के लिए अपने प्रभाव का लाभ उठाने के लिए डिजाइन किया गया था। कार टी सेल खुराक, TMZ परहेजों, और रेडियोथेरेपी प्रशासन विवो टी स?...

Glioblastoma (जीबीएम) सबसे आम प्राथमिक घातक ब्रेन ट्यूमर है और सदा ही घातक है। देखभाल कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी के गैर विशिष्ट मानक के साथ युग्मित शल्य लकीर पूरी तरह से इस रोग एक साथ रोगियों में कम से कम 15 महीने की एक निराशाजनक रोग का निदान, जिसके परिणामस्वरूप में घातक कोशिकाओं को खत्म करने में विफल रहता है। इसके विपरीत, immunotherapy के लिए विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक सटीक तरीका प्रदान करता है, और इस तरह जमानत के विषाक्तता 2-4 की कम जोखिम के साथ एक अत्यधिक प्रभावी उपचार के मंच के रूप में काम करने की क्षमता है। टी कोशिकाओं चिमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर्स (कार) ट्यूमर प्रतिरक्षा चिकित्सा के लिए एक बहुमुखी रणनीति की पेशकश को व्यक्त करने के पूर्व vivo इंजीनियर। सीएआर परिसर में एक पूरी लंबाई की प्रमुख उतक अनुरूपता के एवज में एक या एक से अधिक इंट्रासेल्युलर टी सेल संकेत अणु (एस) के साथ एक एंटीबॉडी का बाह्य चर क्षेत्र fusing द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं (एमएचसी) टी सेल रिसेप्टर 5 -restricted। एंटीबॉडी की तरह प्रतिजन सम्मान की यह विधाप्रतिक्रियाशील प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को समझते हैं और एमएचसी के अभाव में ट्यूमर एंटीजन का जवाब और एक लगभग अनंत प्रतिजन प्रदर्शनों की सूची के लिए अनुकूलित किया जा सकता करने के लिए पर अनुमति देता है। ट्यूमर एंटीजन की एक किस्म के खिलाफ इंजीनियर कार टी कोशिकाओं क्लिनिक 6-9 में पूर्व नैदानिक ​​प्रभावकारिता और बकाया वादा दिखाया है। विशेष रूप से, जीबीएम के संदर्भ में, एक कार टी सेल मंच को लक्षित epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर संस्करण तृतीय (EGFRvIII), एक ट्यूमर विशेष उत्परिवर्तन कोशिका की सतह पर 10 व्यक्त की, तंत्रिकाबंधार्बुद असर चूहों 11 में अस्तित्व को लम्बा करने के लिए दिखाया गया था। उनकी बहुमुखी प्रतिभा के बावजूद, हालांकि, कार दत्तक चिकित्सा के नैदानिक ​​लाभ पूरी तरह से कारण ट्यूमर जुड़े प्रतिरक्षादमन और प्रतिरक्षा चोरी 12-16 के रूप में अच्छी तरह से स्थापित करने और इन विवो में प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को बनाए रखने में चुनौतियों का सामना करने के हिस्से में महसूस नहीं किया गया है। Immunotherapy के साथ देखभाल (समाज) के मानक का इस्तेमाल संभावित इन एल के कई दूर कर सकते हैंनकल, दोनों पूर्व नैदानिक ​​और नैदानिक ​​सेटिंग में बढ़ाया प्रभावकारिता में जिसके परिणामस्वरूप। के बाद लकीर जीबीएम के लिए समाज के उच्च खुराक temozolomide (TMZ), एक डीएनए क्षारीकरण एजेंट 17, और पूरे मस्तिष्क विकिरण (WBI) के होते हैं 1। इन उपचार ट्यूमर एमएचसी अभिव्यक्ति 18-20 की upregulation और मृत ट्यूमर कोशिकाओं 17,19,21,22 द्वारा एंटीजन के छप्पर के माध्यम से ट्यूमर टीकों के साथ तालमेल कायम करने के लिए माना जाता है। दरअसल, पूर्व नैदानिक ​​सेटिंग में प्रतिरक्षा आधारित उपचार के लिए बढ़ाया अर्बुदरोधी प्रभावकारिता को TMZ 20,23 या WBI 18,24 सुराग के अलावा। इसके अलावा, कई गैर विशिष्ट साइटोटोक्सिक केमोथेरापी तरह, TMZ दत्तक चिकित्सा प्लेटफार्मों 27-29 के लिए मेजबान कंडीशनिंग के एक साधन के रूप में leveraged किया जा सकता है, जो प्रणालीगत lymphopenia 25,26, पैदा करने के लिए जाना जाता है। TMZ की मध्यस्थता lymphodepletion एक adop की वृद्धि की प्रभावकारिता के लिए अग्रणी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की आवृत्ति और समारोह को बढ़ाने के लिए दिखाया गया हैintracranial ट्यूमर 30 के खिलाफ सक्रिय चिकित्सा मंच। कार चिकित्सा के संदर्भ में, lymphodepletion दोनों इस प्रकार अर्बुदरोधी गतिविधि 11,34 बढ़ाने, अंतर्जात शमन टी कोशिकाओं 31 की संख्या को कम करने, और साइटोकिन्स 33 के लिए कम प्रतियोगिता के माध्यम से समस्थिति प्रसार 32 उत्प्रेरण द्वारा मेजबान कंडीशनिंग के एक साधन के रूप में कार्य करता है। समाज के संदर्भ में उपन्यास दत्तक चिकित्सा और टीका प्लेटफार्मों का मूल्यांकन प्रभावकारिता के बारे में सार्थक निष्कर्ष ड्राइंग के लिए महत्वपूर्ण है, जीबीएम समाज और immunotherapy प्लेटफार्मों के बीच synergistic संबंध को देखते हुए। इस प्रोटोकॉल में, हम EGFRvIII पॉजिटिव intracranial ट्यूमर (उपचार समय के लिए चित्रा 1 देखें) असर चूहों में TMZ और WBI साथ murine EGFRvIII-विशिष्ट कार टी कोशिकाओं की पीढ़ी और नसों में प्रशासन के लिए एक विधि रूपरेखा। संक्षेप में, कार टी कोशिकाओं रेट्रोवायरल पारगमन द्वारा पूर्व vivo बना रहे हैं। मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं तो काटा और समानांतर में सुसंस्कृत हैं कि सक्रिय murine splenocytes transduce करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो वायरस, निर्माण करने के लिए (कार वेक्टर और PCL-पारिस्थितिकी प्लास्मिड युक्त) एक डीएनए / लिपिड जटिल का उपयोग कर ट्रांसफ़ेक्ट हैं। कार पीढ़ी के दौरान, EGFRvIII पॉजिटिव intracranial ट्यूमर असर murine मेजबानों नैदानिक ​​समाज के लिए तुलनीय खुराक पर fractionated पूरे मस्तिष्क एक्स-रे विकिरण और प्रणालीगत TMZ उपचार प्रशासित रहे हैं। कार टी कोशिकाओं तो lymphodepleted मेजबानों को नसों के द्वारा दिया जाता है। निम्नलिखित प्रक्रिया सात अलग चरणों में वर्णित है: ट्यूमर असर, ट्यूमर असर चूहों की (2) पूरे दिमाग विकिरण, चूहों (3) अभिकर्मक के लिए Temozolomide (1) प्रशासन, (4) splenectomy और टी सेल तैयार करना, (5 ट्यूमर असर चूहों को (6) कार टी सेल संस्कृति और हार्वेस्ट, और (7) कार टी सेल प्रशासन) पारगमन,। इन चरणों को 6-7 दिनों की अवधि और समवर्ती प्रदर्शन कर रहे हैं कि कई कदम से मिलकर बनता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1130">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Name of Material</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:125px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:449px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector</td>
			<td>Imgenex</td>
			<td>10045P</td>
			<td>Helper vector for generating CAR retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Concanavalin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retronectin</td>
			<td>ClonTech/Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td>Facilitates retroviral transduction of T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>HEK293 culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>T cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM 2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>Reducing agent to remove free radicals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin (50 mg/mL)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Standard&#160;Grade&#160;</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pharm Lyse (10X concentrate)&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>Lyses red blood cells during splenocyte processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Filters away large tissue particles during splenocyte processing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356469</td>
			<td>Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Temozolomide</td>
			<td>Best Pharmatech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lyophilized powder prepared on the day of administration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Necessary for complete dissolution of temozolomide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>IM 0132 (5/04)</td>
			<td>Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketathesia HCl</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>11695-0701-1</td>
			<td>Ketamine solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed</td>
			<td>Lloyd Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Xylazine sterile solution 100 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of car t cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

कार टी कोशिकाओं EGFRvIII कार रेट्रोवायरल वेक्टर 11 के साथ पारगमन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। इस वेक्टर, MSGV1, murine स्टेम सेल वायरस (MSCV) लंबे टर्मिनल दोहराता है, विस्तारित झूठ क्षेत्र और लिफाफा ब्याह साइट शामिल ह?...

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Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

देखभाल के ग्लियोब्लास्टोमा मानक के संदर्भ में दत्तक थेरेपी के लिए कार टी कोशिकाओं की पीढ़ी

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

माउस टी कोशिकाओं में टी सेल रिसेप्टर्स की रेट्रोवायरल transduction

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Multivirus विशेष टी कोशिकाओं की पीढ़ी को रोकें / allogeneic hematopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद वायरल संक्रमण का इलाज

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

प्राथमिक मानव भोले और स्मृति टी कोशिकाओं से प्रेरित विनियामक टी कोशिकाओं की पीढ़ी

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं की piggyBac Transposon सिस्टम संशोधन

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

मिलान विशेष टी कोशिकाओं की MHC tetramer आधारित संवर्धन: पेप्टाइड

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

मधुमेहजनक सीडी 4 की दत्तक स्थानांतरण से चूहे में त्वरित टाइप 1 मधुमेह प्रेरण + टी कोशिकाओं

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

एफडीए को मंजूरी दी वेरो कोशिकाओं में टीके के विकास के लिए संयोजक arenavirus की पीढ़ी

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Hematopoietic progenitors के दत्तक हस्तांतरण का उपयोग कर Peyer पैच में murine plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं के विकास का आकलन

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

परिधीय रक्त से मानव Alloantigen विशेष टी कोशिकाओं की पीढ़ी

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Effector के सीडी 4 की दत्तक हस्तांतरण द्वारा Murine आंतों में सूजन की प्रेरण<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; उच्च</sup&gt; Immunodeficient चूहों में टी कोशिकाओं

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...