Name: an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System at JoVE.com

אנו מודים ק דייזרות &#39;וס&#39; Je למבני lentiviral ChR2 וSynapsin1-tdTomato בהתאמה, ג חי לשיתוף מומחיות ופרוטוקול על דור iPSC, WY Leong לקבלת תמיכה טכנית, אנשי המעבדה Goh לחומרים כימיים שיתוף ומומחיות. עבודה זו נתמכה על ידי אבוט תזונה והמרכז האקדמי של אקסלנס (ACE) הפרס מחקר מGlaxoSmithKline (GSK) לElg, על ידי קרן המחקר הלאומית סינגפור במסגרת תכנית המחקר התחרותית שלה (NRF 2,008 NRF-CRP 002-082) לElg ו GJA, ועל ידי World Class המכון (WCI) התכנית של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) ממומנת על ידי משרד חינוך, מדע והטכנולוגיה של קוריאה (MEST) (NRF גרנט מספר: WCI 2,009-003) לGJA

<ol>
	<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice.">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Stroh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+stem+cell+differentiation+in+the+setting+of+automated+optogenetic+stimulation.">Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation.</a> Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).</li><li>Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+adopt+and+regulate+the+activity+of+an+established+neural+network.">Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).</li><li>Viviani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+coculture+of+neurons+and+glial+cells.">Preparation and coculture of neurons and glial cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).</li><li>Braun, H., G&#252;nther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+of+human+iPS-cells+in+a+rat+cortical+primary+culture.">Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).</li><li>Shivaraj, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taurine+induces+proliferation+of+neural+stem+cells+and+synapse+development+in+the+developing+mouse+brain.">Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain.</a> PLoS ONE. 7, e42935 (2012).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors.">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li><li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics.">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li><li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Optogenetics מספק דיוק של זמן ומרחב להפעלה של אוכלוסיות מוגדרות של נוירונים 13. בניסויים שלנו, את כל השדה של המטרה מיקרוסקופ היה מואר למשך 30 שניות לנוירונים בקליפת המוח רק צילום לעורר להביע ChR2. זה אפשר לנו לקבוע אם קשרים סינפטיים נוצרו בין אוכלוסיות השונות של תאי עצב בשיתוף התרבות. התוצאות שלנו גילו כי photostimulation מגביר תדירות PSC בנוירונים נגזרים iPSC, שמוכיח כי תאי העצב האלה לקבל קלט סינפטי מנוירונים בקליפת המוח presynaptic להביע ChR2. זה, בתורו, קבע כי נוירונים נגזרים iPSC שולבו בהצלחה במעגלים עם נוירונים בקליפת המוח. ישנם מספר צעדים קריטיים עבור הדור של מערכת שיתוף תרבות זו. חשוב לוודא שתרבויות astrocyte נגזרים NPC העכבר בריאים, עם מותם של תאים מינימאליים, לפני שתמשיך עם ציפוישל סוגי תאים אחרים. נוירונים בקליפת המוח וNPCs האנושי לצרף גם על האסטרוציטים בריאים וקלטות אלקטרו תלויות במידה רבה בתנאי תרבות. הצעדים המרכזיים האחרים בפרוטוקול זה הם electroporation וציפוי של תאי עצב בקליפת המוח על תרבויות astrocyte. כמספר גדול של תאים מתים לאחר electroporation, חשוב להבטיח כי לפחות 6 מיליון תאי עצב בקליפת המוח הם electroporated לציפוי על תרבויות astrocyte בצלחות 24 גם. ראינו כי כאשר פחות מ -6 מיליון תאים electroporated, מספר הנוירונים ששרדו לא יוצר רשת עצבית צפופה, שהשפיעה על קלטות אלקטרו. מספר תאי העצב בקליפת המוח electroporated צריך גם להיות עקבי עבור כל ניסוי שיתוף תרבות כדי לאפשר השוואה בין מחקרים שונים. לכל השלבים כרוכים בעיכול אנזימטי, זה חיוני שלא לעזוב את התאים בתמיסת עיכול במשך זמן רב מדי מכיוון שהוא עלול להוביל למוות של תאים. זהגישה יכולה לשמש מסך היכולת של תאי עצב שמקורם fibroblasts מטופל ספציפי ליצירת קשרים סינפטיים עם תאי עצב אחרים. נוירונים נגזרים מfibroblasts מחולים הסובלים מהפרעת נוירו-התפתחות תסמונת רט (RTT) תערוכת פגמי שידור סינפטי: תאי עצב RTT להציג ירידה משמעותית בתדירות ומשרעת PSC בהשוואה לנוירונים בריאים, ככל הנראה בשל פחות קישוריות הסינפטי 14. מערכת שיתוף התרבות שלנו מאפשרת בדיקה של שפעות תרופה על תאי עצב בו מוצגות פגמים התפתחותיים. זה יכול להתבצע באמצעות תוספת של תרכובות של ריבית במהלך הזריעה של NPCs אדם החולה, כמו גם במהלך חשיפה ממושכת לתרכובות בכל עת ההבחנה עצבית. בעוד מערכת שיתוף תרבות זו יכולה לשמש גם כמודל לבדיקות סמים, הגבלה בגישה זו היא שהתהליך של לחקור את ההשפעות של כל מתחם מועמד יכול להיות ארוך ומייגע כזה לא שיטת הקרנת תפוקה גבוהה. בעקבות טיפול עם תרכובות מועמד, הנוירונים נגזרים iPSC צריכים להיות תוקנו בנפרד כדי לקבוע את ההשפעות של כל מתחם על PSCs. יתר על כן, יש כיום לא רב fibroblasts זמין וiPSCs מחולים. לכן, זה יהיה העניין בעתיד הקרוב לתאים חולים יותר וגם כדי להתאים פרוטוקול זה להקרנת תפוקה גבוהה. לדוגמא, על ידי תיוג נוירונים נגזרים iPSC עם מחוון פעילות, כגון חיישנים גנטי מקודדים של יונים או פוטנציאל הממברנה, אפשר יהיה להגביר את קצב התפוקה באופן משמעותי על ידי הליך אלקטרו זמן רב דריכה בצד. ככל התהליך של יצירת מערכת שיתוף תרבות זו, מתכנות מחדש fibroblasts לביצוע הקלטות אלקטרו, דורש יותר מ -90 ימים, מומלץ שיורחב גם iPSCs או NPCs האדם, לאחר תכנות מחדש וצעדי אינדוקציה עצביים בהתאמה,וcryopreserved כדי לצמצם את הזמן דרוש לניסויים עתידיים. בניסויים שלנו, אנו הביעו ChR2 בנוירונים בקליפת המוח תחת אמרגן synapsin1. בגלל אמרגן זה פאן-עצבי, אנחנו כנראה היו photostimulating שני תאי עצב בקליפת המוח מעכבים ומעוררים. אם המטרה של ניסויים עתידיים היא לחקור את אופן ספציפי מעגלים או מעכבים או מעוררים, יכולים לשמש יזמים ספציפיים יותר. לחלופין, ניתן היו להשיג נוירונים בקליפת המוח ממהונדס (או מוזרק וירוס עכברים) שבו ביטוי ChR2 הוא ממוקד במיוחד לאוכלוסיות גנטית מוגדרות של תאי עצב. לדוגמא, רקמות קליפת המוח קציר מעכבר שיש recombinase Cre באו לידי ביטוי בinterneurons המכיל parvalbumin (interneurons PV) שהוא חצה עם עכבר עם ChR2 floxed יניב מצב שבו נוירונים בקליפת המוח רק להביע ChR2 יהיו interneurons PV 15. השימוש בChR2 להביע interneurons בנו שיתוף מ&quot;ק כזהמערכת lture תאפשר הקביעה אם נוירון נגזר iPSC שתוקנה הוא מסוגל לשלב במעגל עם interneurons PV. בהתבסס על מחקר קודם 9, נוירונים בקליפת המוח הם בוגרים עם חופף דנדריטים לאחר 14 ימים במבחנה. לכן, אם photostimulation לא לעורר תגובה מתא עצב נגזר iPSC טלאים, זה צריך להצביע על כך שתא העצב אין לו את היכולת ליצור קשרים סינפטיים עם תאי עצב בקליפת המוח. נוירון נגזר iPSC יכול לקבל קלט סינפטי או מתא עצב או נוירונים בקליפת המוח נגזר iPSC אחרים. אם הקלטות מהדק תיקון מסורתי שמשו, זה יהיה לא ניתן להבחין בו קלט סינפטי הוא בא. היתרון של המערכת שלנו הוא שתגובות postsynaptic מקלט סינפטי קליפת המוח יכולות להיות עורר באופן סלקטיבי וזיהו. הנהלים המתוארים כאן מספקים גישה פשוטה כדי להעריך את היכולת של הנוירונים נגזרים iPSC לשלבלרשת עצבית מוגדרת.

בשנים האחרונות, ההבנה של נוירון ותפקוד מעגל העצבי שלנו כבר מהפכה ידי מספר כלים optogenetic השולטים רגישות עצבית. כלי אחד כזה הוא ערוץ קטיון מופעל אור, channelrhodopsin-2 (ChR2): תאי עצב המבטאים פוטנציאל פעולת אש ChR2 בתגובה לגירוי אור 1-3. מכיוון שתאי עצב אינם בדרך כלל רגישים לאור, יכולת המופלאה זה פותחת אפיקים חדשים לשליטה של זמן ומרחב המדויק של הפעילות של אוכלוסיות גנטית מוגדרות של נוירונים 4 והואצה מחקרים של תפקוד המוח מאוד. ChR2 הוחל על תא גזע מחקר למטרות שונות, ממעקב אחר ההתפתחות עצבית 5 להסדרת פעילות של רשתות עצביות 6. כאן השתמשנו ChR2 להגדיל את התועלת של מערכת שיתוף תרבות עצבית. מערכות שיתוף התרבות לאפשר ההערכה של יחסי גומלין בין תאים מסוגים שונים.שיתוף תרבויות של תאי עצב וגליה, סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים, משמשים בדרך כלל כדי לחקור איתות בין סוגי התאים השונים הללו, כמו גם כדי להעריך את המשמעות של זה איתות לתגובות פיסיולוגיות, התפשטות של נזק ולבחון את מנגנונים מולקולריים הפוטנציאליים מעורבים בזה איתות 7. מחקר קודם גילה כי iPSCs האנושי להבחין מהר מאוד לתאי עצב בנוכחות של תאי עצב בקליפת המוח חולדה עיקרי תרבות המכילה, האסטרוציטים, oligodendrocytes, ומיקרוגליה 8. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים שיטה שמנצלת ChR2 במערכת שיתוף תרבות לחקור את קשרים סינפטיים בין תאי עצב בקליפת המוח חולדה ותאי עצב שמקורם בתאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (iPSCs). אנו מתארים את שלבים לנתח ורקמות מוח קציר 9, כמו גם לשמור ולבדל את תאים עצביים עכבר (NPCs) להאסטרוציטים וNPCs אדם intנוירונים o ליצור מערכת שיתוף התרבות. להקים מערכת שיתוף תרבות זו, השתמשנו בשיטת תכנות מחדש ללא אינטגרציה שתוארה על ידי אל Okita et. 10 כדי ליצור iPSCs האנושי. iPSCs אלה אז נבדל ביעילות לתוך NPCs בתנאים כימי מוגדרים באמצעות מעכבי מולקולה קטנה כפי שתוארה על ידי et al לי. 11 בשיתוף התרבויות, אוכלוסיות השונות של תאי עצב יכולות להיות מזוהות באמצעות זיהוי של ביטוי ChR2 בנוירונים בקליפת המוח ותיוג של נוירונים נגזרים iPSC באמצעות חלבון הניאון, בד בבד דימר העגבניות (tdTomato). שילוב קלטות אלקטרו מהנוירונים נגזרים iPSC עם photostimulation optogenetic של נוירונים בקליפת המוח מאפשר הערכה של היכולת של שני סוגים של תאי עצב כדי ליצור מעגלים אחד עם השני. באופן ספציפי, photostimulation של ChR2 להביע תאי עצב בקליפת המוח לעורר תגובות הסינפטי בנוירונים נגזרים iPSC שיצרו מעגלים הסינפטיעם רשת נוירון בקליפת המוח photostimulated. אנו מראים כי זרמי postsynaptic מוגברים אכן זוהו בתאי עצב שמקורם בiPSC בתנאים כאלה. פרוטוקול זה מאפשר ההערכה של מעגלים הסינפטי תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי, כוללים סיכום של דגמי מחלה נוירולוגית שונים באמצעות iPSCs נגזר מfibroblasts מחולי מחלה.

an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

כאן, פרוטוקול המתאר את השלבים המרובים מעורבים ביצירת התרבות משותפת מורכבות האסטרוציטים, נוירונים בקליפת המוח ותאי עצב אנושיים באו לידי ביטוי. iPSCs אדם התקבלו על ידי תכנות מחדש fibroblasts באמצעות episomal וקטורי 10 וצוין לשושלת עצבית עם קוקטייל של מעכבי מולקולה קטנה, מה שהופך את NPCs 11 שנשמרו בצפיפות גבוהה (איור 1 א). כמה צעדים נדרשים כדי ליצור התרבות המשותפת: בידול של NPCs עכבר להאסטרוציטים, ציפוי של תאי עצב בקליפת המוח חולדה להביע ChR2, וזריעה של NPCs אדם מתויג עם tdTomato (איור 1). ביום 2 של בידול, חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) + האסטרוציטים יכול בקלות להיות שנצפו בתרבויות שלנו (איור 1 ג). עכבר NPCs הורשו להבחין במשך שבוע לפחות לפני ציפוי נוירונים בקליפת המוח להביע ChR2 על monolayer astrocyte (1D איור). לאחר 3עד 4 שבועות של בידול NPC האנושי, תאי עצב tdTomato + התגלו בתרבויות (איור 1E). מערכת שיתוף התרבות זו מאפשרת זיהוי עקבי של זרמי postsynaptic מהנוירונים נגזרים iPSC בודדים בתגובה לגירוי אור (איור 2 א). כאשר מגורה על ידי אור, פוטנציאל פעולה נוצרו בתאי עצב בקליפת המוח להביע ChR2 (איור 2). הנגזר iPSC נוירונים גם להתרגש (איור 2 ג), מראה ירי פוטנציאל פעולה מוגבר כהמשרעת של depolarizing פולסים נוכחי הוגדל (איור 2 ד). כך, תאים אלה תערוכת תכונות עצביות בוגרות. בהעדר האור, תאי עצב נגזר iPSC קיבלו תשומות ספונטניות הסינפטי (איור 2E). זרמים פנימה postsynaptic אלה בתיווך בעיקר על ידי קולטני AMPA, כי זרמים דרך קולטני GABA יהיו כלפי חוץ וקולטני NMDA לא לשאת נוכחיt פוטנציאל החזקת -70 mV. לפחות חלק מהתשומות אלה היו מנוירונים בקליפת המוח presynaptic להביע ChR2, כי גירוי אור הגביר את התדירות של זרמי postsynaptic (איור 2E) באופן משמעותי. כמובן של גידול זה בקלט סינפטי הזמן מוצג באיור 2F: photostimulation של נוירונים בקליפת המוח שספג לאורך כל הבזק אור ארוך 30 שניות. בעוד התדירות של PSCs הייתה גבוהה כאשר תאי עצב בקליפת המוח להביע ChR2 היה photostimulated (איור 2G), משרעת שלהם לא נפגע (איור 2H). לסיכום, תוצאות אלו מצביעות על כך שתאי העצב נגזר iPSC הציגו תכונות עצביות בוגרות ויכולים ליצור קשרים סינפטיים עם תאי עצב בקליפת המוח presynaptic. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> איור 1: תרשים סכמטי עבור הדור של תרבות המשותפתציר זמן מערכת. (א) לתכנות מחדש fibroblasts האנושי לiPSCs ואינדוקציה עצבית לNPCs. ציר זמן (B) לבידול מסוף של NPCs האנושי לתאים בוגרים בתרבויות נוירון וastrocyte קליפת המוח. (C) העכבר NPCs להבחין במהירות לתוך GFAP + האסטרוציטים אחרי 2 ימים במבחנה. (ד &#39;) לאחר שבוע אחד, נוירונים בקליפת המוח להביע ChR2 היו מצופים על האסטרוציטים GFAP +. (E) בשעת 4 עד 5 שבועות לאחר ההתמיינות של NPCs האנושי, קלטות אלקטרו בוצעו על tdTomato + נוירונים. ברים סולם מייצגים 100 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> איור 2: ניתוח optogenetic של קישוריות הסינפטי פונקציונלית. נגזר iPSC () תאים מתויגים עם tdTomato (אדום) היו שיתוף תרבותיים עם נוירונים בקליפת המוח המבטאים את האור מופעל-ערוץ, ChR2 (ירוק). הקלטות מתא העצב נגזר iPSC חשפו תגובות postsynaptic הנוכחיות (PSC), שיכול לבוא משני נוירונים בקליפת המוח או נוירונים נגזרים iPSC אחרים. (ב) תאורה (פס כחול) עוררה שורה של פוטנציאל פעולה בתאי עצב בקליפת המוח להביע ChR2. ( נגזרים תאי iPSC C) הם עוררו על ידי הזרקה נוכחית. (ירי D) לעומת עקומה הנוכחית של נגזרים תאי iPSC. (E) photostimulation של נוירונים בקליפת המוח ChR2 להביע (פס כחול) הגבירו את התדירות של PSCs בנוירונים נגזרים iPSC . כמובן (F) זמן של העלייה בתדירות PSC המיוצרת על ידי photostimulation. בר כחול מציין זמן של photostimulation. (G, H) בעוד תדירות PSC הוגדלה על ידי photostimulation (G), משרעת PSC לא נפגע (H). * מציין p &lt;0.05 לעומת שליטה במבחן t.

Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System at JoVE.com

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...