Name: cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

BEMÆRK: Alle procedurer denne protokol udføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra Det Forenede Kongeriges indenrigsministerium og University of Edinburgh Veterinary Services. 1. Infektion af mus med sonde <ol><li> Store Heligmosomoides polygyrus L3 larver i destilleret vand i op til seks måneder ved 4 ° C. </li><li> Før brug, vask L3 larver tre gange i destilleret vand: centrifugeres ved 300 xg i 10 min (med bremse), fjerne alle men 500 pi vand (for at undgå forstyrrende pelleteret L3 larver), og pellet resuspenderes hver gang. </li><li> For den tredje vask, tilsæt vand til en nøjagtig mængde (typisk 40 ml) og aspireres 20 pi med 200 pi tip cut udvide dens åbning. Placer to 20 pi prøver på overfladen af ​​en 60 mm dyrkningsskål og tælle L3 larver (normalt mobil, og ses bedst under 50X forstørrelse med et dissektionsmikroskop). Resuspender den endelige pellet i destilleret vand til en concentration på 2.000 L3 larver pr ml. </li><li> For livscyklus produktion, inficere 8 uger gamle F1 (C57BL / 6xCBA) mus med 400 H. polygyrus L3 larver i 200 pi destilleret vand ved oral gavage (begrænse mus i opretstående stilling ved nakken og forsigtigt passere stump sonde nål gennem munden og spiserøret ind i maven). Omrør grundigt før hver infektion (larver afregne hurtigt i vand) og aspireres 200 pi i en 1 ml sprøjte; bruge en dedikeret gavagenål med en afrundet ende. For eksperimentel infektion af yngre mus (6-8 uger gamle), eller andre indavlede stammer (f.eks C57BL / 6 eller BalbC), inficere mus med 200 L3 larver. </li></ol> 2. Formering og Vedligeholdelse af H. polygyrus <ol><li> Placer trækul i midten af ​​en stor plastik badekar og tillade koldt ledningsvand til at køre over det i mindst 30 min (uvaskede aktivt kul er toksisk for L3 larver). Dræn vandet fra karret og sæt kul på two lag af absorberende papir, der forlader det udsættes for rumluft indtil helt tør. </li><li> Hvis æg er nødvendige, skrabe fæces først ud af tyktarmen med pincet (og sakse hvis nødvendigt). Hvis et stort antal L3 larver er nødvendig, anbringes musene på et trådgitter og indsamle fækalpellets over flere dage. </li><li> Bland fæces med granuleret kul i et forhold på mindst 1: 1, for at opnå en konsistens bare fugtig nok til at klæbe til filterpapir. Smør et tyndt lag på midten af ​​nogle afdæmpede filterpapir i en petriskål og placere denne i et fugtigt kasse (tilføje nogle fugtigt køkkenrulle og en skål af vand) i mørke i 12-14 dage. </li><li> Fjern L3 larver fra dag 7 og frem, og samle dem på mindst to gange, inden papiret kasseres. Larverne danner en ring omkring kanten af ​​filteret papir; løfte filtrerpapiret ud af petriskålen og skyl larver, der er tilbage af pladen (ved hjælp af en pipette og 5 ml sterilt vand pr plade) i et 50 ml rør. </li><li> Liftoff filtrerpapiret og høste de resterende larver tilbage på pladen med destilleret vand i et 50 ml rør. Centrifugeres spildevandet opløsning ved 300 xg i 10 min. Vask larverne tre gange med destilleret vand og derefter opbevares ved 4 ° C i op til 50 ml destilleret vand, indtil behov. BEMÆRK: Larver forbliver levedygtige og smitsomme i mindst 6 måneder. </li></ol> 3. Indsamling af Adult H. polygyrus Worms <ol><li> Forbered modificerede Baermann Apparat på forhånd som vist i figur 1. </li><li> Cull mus Fjorten dage efter infektion. </li><li> Vask maven med 70% ethanol. Skær huden over maven og trække sig tilbage for at afsløre maveskindet. Gør midtlinieincision at indtaste bughulen. </li><li> Fjern hele tynd- og tyktarmen (fra proksimale duodenum til den distale rektum). Placer i en tør petriskål. </li><li> Ret tarmen langs hele sin længde; udskære fæces indeholdende kolon; placere denne i en separat skål for æg præparater senere. </li><li> Udskære proksimale 20 cm af tyndtarmen, der indeholder de voksne orme -identified af forholdsvis tyk væg af duodenum og ofte en rød udseende på grund af intra-luminale orme. Anbringes i et (100 mm i diameter) petriskål med 5 ml Hanks opløsning, opvarmet til 37 ° C (to prøver pr skål). </li><li> Åbn ormen fyldt proksimale gut portion på langs med en saks (runde ender saks er bedst til dette), og skrab ned indersiden af ​​tarmen foring med to glasplader til at fjerne orme. Derefter kasseres ren tarmvæggen. </li><li> Tip orme i små musselin poser, hæfte lukket og sikkert med papirclips omkring kanten af tragten glasset (figur 1). </li><li> Fyld tragt med Hanks Solution og tilsæt ca. 4 petriskåle af orme i hver tragt. </li><li> Placer apparatet i 37 ° C inkubator i 1-2 timer, forsigtigt omrøring halvvejs igennem for at fjernerester fra tarmen præparat, der kan okkludere musselin filter. Sørg for at undgå spild af vragdele uden for musselin taske - dette vil medføre forurening af den endelige HES forberedelse. Voksne orme skulle langsomt migreret gennem musselin klud og afregnes i bunden af ​​glasset reagensglas. Frigør forsigtigt reagensglasset fra den forbindende gummislange over vasken (Pas på ikke at miste orme på dette tidspunkt). </li><li> Ved hjælp af en plastik pipette ormene i et 50 ml rør og vask seks gange med Hanks Solution (tillade orme nøjes med tyngdekraften, fjerne medier med en stripette, tilsættes 40 ml Hanks opløsning og gentag fem gange). BEMÆRK: orm kultur skal holdes sterilt fra dette punkt og fremefter. <ol><li> Flyt til en laminær strømning og vaskes yderligere seks gange i steril Hanks &#39;opløsning suppleret med 100 U / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin, klar til in vitro kultur. </li></ol></li><li> Tælvoksne orme inddrevet ved at tage to prøver af 20 pi taget op med en gul spids snit til at udvide sin blænde; forvente ca. 50% af den mængde af inokuleret larver. </li></ol> 4. Opsætning af kulturer til HES: Medium Forberedelse, vask voksne orme <ol><li> Soak orme fra 3,11 i ca. 10 ml RPMI suppleret med 10% Gentamycin i 20 minutter, hvorefter røret hviler i en vinkel for at sikre, orme er fuldt dækket. </li><li> Udfør dette i en laminær strømning: Vask igen seks gange med Hanks &#39;opløsning (suppleret med 5 U / ml penicillin og 5 ug / ml streptomycin). </li><li> Forbered H. polygrus medier. </li><li> Fastholdelse sterilitet i en laminær strømning, til 500 ml RPMI1640, tilsættes 11,1 ml af 45% glucose (slutkoncentration 1,2% RPMI1640 indeholder 0,2% glucose), 5 ml 100x Peniclllin-streptomycin (slutkoncentration 5 U / ml penicillin, 5 ug / ml streptomycin), 5 ml L-glutamin (slutkoncentration 2 mM), og5 ml gentamycin (slutkoncentration 1%). Tilføj ikke FCS. </li><li> Alikvote orme i ventilerede T25 kolber ca. 1.000 orme i 15 ml H. polygyrus medier pr kolbe og sted oprejst i 37 ° C inkubator (5% CO2) i 3 uger. </li></ol> 5. Fremstilling af HES <ol><li> Saml HES-holdige dyrkningsmedier fra kulturer med intervaller på højst to gange om ugen, en ophævelse af den første kollektion efter 24 timer af kultur (på grund af høje niveauer af LPS forurening og værtsproteiner - kan behandles hver for sig eller kasseret). Hold hver kollektion adskilt og tydeligt mærket med dato og batchnummer. Erstat med et lige volumen af H. polygyrus medier hver gang. </li><li> Centrifuge HES-holdige medier ved 400 x g i 5 minutter. Derefter Filtersteriliser gennem 0,2 um lav proteinbindende filtre i 50 ml rør. Opbevares i -20 ° C fryser tydeligt mærket med dato for orm høst og dato for HES collection. </li><li> Efter 21 dage HES kollektion fra kultur, kassere orme. </li><li> Pool 500-1.000 ml HES supernatant (normalt fra frossen lager, og ikke inklusive den første 24 timers samling) og koncentrere over en 3.000 MWCO filter i ultrafiltreringsindretningen under nitrogen pres. BEMÆRK: Vær meget forsigtig med ikke at lade filteret køre tør. <ol><li> For at opsætte filteret enheden først vaske 3 kDa membran blanke side nedad i en 1 liters bæger med destilleret vand i 3 x 20 min under omrøring. Saml ultrafiltreringsindretningen ifølge producentens anvisninger med filtermembran skinnende opad. Anbring i skab ved 4 ° C og videregive 50 ml destilleret vand igennem, før du begynder at koncentrere puljede HES. </li><li> Tilføj hvert rør af HES til filtrering enhed efter behov (100-140 ml pr dag), indtil lydstyrken er koncentreret ned til 2-5 ml. </li></ol></li><li> For at fjerne kontaminanter fra HES-holdige dyrkningsmedier, tilsættes 50 ml pyrogen-fri PBS til filtrering enheden og derefter koncentreres til ca. 2 ml. Gentag dette trin to gange (150 ml PBS i alt). Overførsel HES i et 15 ml rør, Filtersteriliser (med et 0,2 um filter) i en laminær strømning og måle proteinkoncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer (E 280 = 10) eller ved Bradford assay. </li><li> Alikvot, label med batchnummer og dato, og fryse ved -80 ° C. </li><li> Udfør en chromogen LAL assay ifølge producentens protokoller for hvert parti af HES før brug. Hvis LPS niveauer er større end 1 U LPS per 1 ug protein, overveje ikke at bruge denne batch til in vivo eksperimenter eller in vitro kulturer. </li><li> Behandle HES indsamlet på 24 timer hver på samme måde; den vil indeholde LPS og nogle værtsproteiner, og samtidig ikke egnet til funktionelle eksperimenter, er det en nyttig kilde til de enkelte molekyler, der kan isoleres ved monoklonalt antistof affinitetsoprensning. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

Livscyklus H. polygyrus provenuet i et pålideligt konsekvent. Efter naturlig indtagelse eller oral sonde af L3 larver på dag 0, cyster begynder at danne under duodenal serosa ved dag 5, udvikler sig til larver fælder og så fremstår som voksne orme i tarmen lumen fra dag 10, kan æg ses i afføring fra dag 14 og granulomer er synlige på den duodenale serøse overflade fra dag 21. Den ovenfor beskrevne (og opsummeret i figur 6) protokol giver mulighed for high-throughput produktion af H. polygyrus ekskretionsorganerne-sekretoriske produkter (HES), foruden pålidelig inddrivelse af levedygtige L3 larver for fremtidige forsøg og livscyklus infektioner. H. polygyrus infektion har vist sig at være beskyttende i modeller for astma afhængige OVA eller Der p 1 (husstøvmideallergen) 14. Endvidere kunne undertrykkelse af luftvejsinflammation overføres med CD4 + CD25 + </sup&gt; regulatoriske T-celler 14 eller CD19 + CD23 hi regulatoriske B-celler 24 fra ikke-lysfølsomme, H. polygyrus inficerede mus. I modeller af autoimmunitet, H. polygyrus infektion har vist sig at være undertrykkende i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) model for dissemineret sklerose 9 og undertrykkelse kan overføres med enten CD4 + T-celler eller CD19 + B-celler fra inficerede mus 24. Heligmosomoides polygyrus udskillelsesvej-sekretorisk produkter (HES) modulere værtens immunrespons og undertrykke Th2-medieret inflammation af en række mekanismer (beskrevet i figur 7), herunder: a) Inhibering af dendritisk celle respons på stimulering 25, b) induktion af CD4 + Foxp3 + regulatoriske T-celler 18. og c) blokade af IL-33 produktion 20. HES har vist sig at være beskyttende, når de indgives ent sensibilisering eller udfordring i OVA-alun astmamodel 19 og også, når det indgives intranasalt med Alternaria ekstrakt allergen 20 gennem suppression af tidlig IL-33 release. Undgåelse af LPS forurening af HES er ofte afgørende for succes i fremtidige immunologiske eksperimenter. I protokollen beskrevet her, de kritiske trin i at opnå dette er at sikre, at affald indeholdt i musselin sække af Baermann apparatet ikke komme ind i sidste HES forberedelse (se 2.10), og at afsætte ES løsning fra de første 24 timer af kultur (se 5.1). I de seneste år har HES blevet grundigt karakteriseret ved proteomisk niveau med over 370 forskellige proteiner identificeret 26,27. Desuden har ES fra 4. stadie larver blevet underkastet proteomanalyse 28. Igangværende arbejde omfatter karakterisering af store glycan komponenter HES, der vides at være stærkt immunogene 3 og udskilles mikro-RNDa der er indkapslet i 50-100 nm vesikler eller exosomer (Buck et al., Der er indsendt til publikation). Med etableringen af reproducerbare protokoller for indsamling af ES fra denne meget immunmodulerende parasit, og med omfattende proteomiske data, der identificerer de molekylære komponenter i HES, er scenen nu indstillet til identifikation og terapeutiske test af individuelle molekyler fra H. polygyrus der kan mediere vigtige virkninger på værtens immunsystem.

Heligmosomoides polygyrus er en naturlig murine gastrointestinal helminth der er nært beslægtet med højt fremherskende humane nematode parasitter 1. I modsætning til andre nematoder modeller som Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus konsekvent etablerer kronisk infektion i mus som et direkte resultat af flere magtfulde immunmodulerende mekanismer den beskæftiger at undertrykke værtens immunrespons 2. H. polygyrus har en direkte livscyklus: infektiøse L3 larver indtages af FeCO-oral transmission (eller administreres af oral sonde i indstillingen laboratorium), hvorefter de vandrer til subserosal lag af duodenum og encyst før han vendte tilbage til tarmlumen som voksne orme cirka otte dage efter indledende infektion. Parring og ægproduktion sker ved dag 10, og det er muligt at høste voksne orme for kultur og indsamling af ekskretionsorganerne-sekretoriske produkter fra day 14 og fremefter 3. H. polygyrus også interagerer med kommensal mikroflora, med øget Lactobacilli stede i inficerede modtagelige mus 4-6 og øgede niveauer af H. polygyrus infektion efter eksponering af mus til Lactobacilli 6. Aktiv infektion med H. polygyrus har vist sig at beskytte mod immunpatologi i mange dyremodeller for autoimmunitet 7-10, colitis 11,12 og allergi 13-16. Der har derfor været stor interesse for mulighederne i Ekskretionsorganerne-Sekretoriske molekyler fra denne parasit (&quot;HES&quot;) til ned-modulere patologi in vivo 17,18. Faktisk er beskyttende virkninger ses efter behandling af mus med HES-produkter 19 gennem veje som nu identificeret 18,20. Her beskriver vi en protokol for pålidelig produktion af Heligmosomoides polygyrus og inddrivelse af sine udskilte produkterder kan yderligere anvendes til en række af funktionelle biokemiske og immunologiske undersøgelser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (tidligere kendt som Nematospiroides dubius, og også nævnt af nogle som H. Bakeri) er en gastrointestinal helminth, der beskæftiger flere immunmodulerende mekanismer til at etablere kronisk infektion i mus og ligner fremherskende humane helminthinfektioner. H. polygyrus blevet omfattende undersøgt med hensyn til helminth-afledte immune regulering og er blevet fundet at kraftigt undertrykke eksperimentelle modeller af allergi og autoimmunitet (begge med aktiv infektion og isolerede udskilte produkter). Beskrevet i dette papir protokol beskriver styring af H. polygyrus livscyklus for ensartet produktion af L3 larver, genvinding af voksne parasitter, og indsamling af deres ekskretionsorganerne-sekretoriske produkter (HES).

Modtagelighed for infektion med H. polygyrus styres i høj grad af den genetiske baggrund af muse-stamme (Tabel 1); C57BL / 6 og CBA-mus er meget modtagelige 21,22. Til vedligeholdelse af parasitten livscyklus, har F1 hybrid mellem disse to stammer valgt for sin evne til at modstå meget højere ormen byrder uden morbiditet (overdreven intestinal epitelbeskadigelse) sammenlignet med enten parentale stamme. Oral sondeernæring på 400 L3 larver anvendes til at opretholde livscyklus i F1-mus (resulterende i voksne orm byrder vist i figur 2), mens en dosis på 200 L3 larver anvendes generelt til eksperimenter i homozygote indavlede stammer (f.eks C57BL / 6 eller Balbc-). Men måske har brug for denne dosis, reduceres afhængigt af miljømæssige co-faktorer, der kan variere fra dyr faciliteter, såsom variationer i tarmfloraen. Partier af HES har vist reproducerbar Efficacy i funktionelle assays og i proteinsammensætning; Desuden, når supernatanter fra hver successiv uge kultur blev analyseret, op til i alt 4 uger blev proteinprofiler fundet at være meget ens (figur 3). Når HES koncentrationen måles med Bradford-assay (se 5.5), den samlede protein er sædvanligvis ca. 1 mg / ml (figur 4). En alternativ fremgangsmåde til at koncentrere HES er med en centrifugal-koncentrator (f.eks VIVASPIN 3 kDa cut-off membran), hvor prøverne centrifugeret ved op til 4000 g i et udsvingsrotor centrifuge, fjernelse buffersalte og lavmolekylære bestanddele. Centrifugal koncentration er bedst egnet til små behandling mængder (1-10 ml) og er begrænset til en maksimal koncentration faktor på ca. 30x. Ved afhentning HES, hindring af kontaminering er kritisk. For at undgå forurening med værten molekyler, vi kassere HES-containing dyrkningsmedier fra de første 24 timer efter voksne orm høst fra musen tarmen. Vi kvantificere også niveauet af LPS forurening i hver batch af HES med en Chromogenic LAL-assay (se 5.7). 1 U af LPS svarer til ~ 100 pg LPS og niveauer under dette betragtes ubetydelige 23. I vores hænder, de fleste partier af HES er væsentligt under denne grænse, var den gennemsnitlige koncentration af LPS i HES er 0,23 U / ug (figur 5). Virkningerne af LPS i in vivo modeller for patologi (fx undertrykkelse af astmatiske reaktioner) kræver mindst 10 ng LPS 23. Derfor in vivo administration af 5 mg HES fra et parti med 100 pg LPS / ug HES vil omfatte 500 pg LPS, et godt stykke under den effektive koncentration, hvor LPS bliver et problem. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figur 1: Baermann Apparat Baermann Apparatur setup for indsamling af voksne H. polygyrus (som beskrevet i afsnit 2). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figur 2: Middel Worm Burden 14 dage efter infektion med 400 L3 Larver Mean orm byrder 14 dage efter infektion med 400 L3 larver. Datapunkter vises er fra 19 forskellige runder af infektion af C57BL / 6xCBA mus. Middelværdi ± SEM er vist. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figur 3: Protein Profiler af HES fra efterfølgende uger i Kultur SDS-PAGE profil HES proteiner indsamlet i successive ugers dyrkning. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figur 4: </sTrong&gt; sidste mængde HES fra 500 ml ES-holdige medier Udbytte af HES protein fra 11 forskellige batches afledt fra ca. 500 ml kultursupernatant. Middelværdi ± SEM er vist. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figur 5: LPS Forurening af HES Niveauer af LPS forurening i 41 partier af HES målt ved Limulus ameobocyte assay. Median LPS koncentration = 86 U pr mg HES. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figur 6: Animated Skematisk af H. polygyrus Life Cycle Resumé af de vigtigste stadier i livscyklussen fra oral sonde af L3 larver gennem Påvisning af larver og voksne orme til isolering af HES. Figur 7: Animated Skematisk af HES og dens funktioner Vigtige immunmodulerende virkninger af opløselige mediatorer og exosomer indeholdt i HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype (og baggrund stamme) </td><td> Primær infektion Fænotype </td><td> Reference </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Indavlede stammer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Meget modtagelige </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 og C57BL / 10 </td><td> Modtagelige </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermediate </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Lav modtagelighed </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene for cytokiner eller cytokinreceptorer </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Mere modtagelige </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Mindre modtagelige (a); ingen ændring i følsomhed, men steg granulomer (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ Transgene (C57BL / 6) </td><td> Resistent </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Højere frugtbarhed </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 eller BALB / c) </td><td> Meget modtagelige </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c eller C57BL / 6) </td><td> Meget resistent </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 Transgene(FVB) </td><td> Resistent </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Mangelfulde Th2, nedsat granuloma gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Mere modtagelige </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Ingen ændring i følsomhed </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> High Th1, øget modtagelighed </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene for T-celle-markører </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Marginalt højere frugtbarhed </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Højere frugtbarhed </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Højere frugtbarhed &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene for medfødte immunsystem loci </td><td></td></tr><tr><td> Type 1 interferon receptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Højere frugtbarhed, flere granulomer </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Mere modstandsdygtige, mere granulomer </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Mere modtagelige </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Primære infektioner med H. polygyrus i genetisk forskellige og gen-målrettet musestammer.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus er en muse nematode med magtfulde immunmodulerende kapaciteter, som svarer bedre til dem af meget udbredt menneskelig helminth-infektion. Her beskriver vi en protokol til vedligeholdelse af H. langsigtet polygyrus livscyklus.

Dyrkning af<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Et immunmodulatorisk Nematode Parasite og dens udskilte produkter

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Parasite Induceret Genetisk Drevet Autoimmun Chagas hjertesygdom i Kylling Model

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En Parasite Rescue og transformationsassay for Antileishmanial Screening mod intracellulære<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoter i THP1 human akut monocytisk leukæmi cellelinje

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Vurdering af immunmodulerende egenskaber af humane mesenchymale stamceller (MSC&#39;er)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering af en High-throughput Opsætning til screening små molekyler, der modulerer c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Udvikling af en økonomisk DNA Delivery System med &quot;Acufection&quot; og dens Anvendelse på Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Hurtig Kvantificering af mitogen-induceret blastogenese i T-lymfocytter til Identifikation Immunmodulerende narkotika

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generation af monoklonale antistoffer mod naturprodukter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...