Name: cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00
Duration: 12 min 40 s
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The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien, die von Großbritannien Home Office und der Universität von Edinburgh Veterinary Services eingestellt geführt. 1. Infektion der Mäuse durch Gavage <ol><li> Shop Heligmosomoides polygyrus L3-Larven in destilliertem Wasser für bis zu sechs Monate bei 4 ° C. </li><li> Vor Gebrauch waschen L3-Larven dreimal in destilliertem Wasser: Zentrifuge bei 300 xg für 10 Minuten (mit Bremse), entfernen Sie alle, aber 500 ul Wasser (um störende pelletiert L3-Larven zu vermeiden) und das Pellet jedes Mal. </li><li> Bei dem dritten Waschen, Wasser hinzufügen, um eine genaue Volumen (in der Regel 40 ml) und saugen Sie 20 ul mit 200 ul Spitze geschnitten, um ihre Öffnung zu erweitern. Platzieren zwei 20-ul-Proben auf der Oberfläche einer 60 mm Kulturschale und zählen die L3-Larven (üblicherweise mobil und am besten unter 50-facher Vergrößerung mit einem Präpariermikroskop betrachtet). Resuspendieren endgültige Pellet in destilliertem Wasser auf ein concentration von 2.000 L3 Larven pro ml. </li><li> Für Lebenszyklus Produktion, infizieren 8 Wochen alte F1 (C57BL / 6xCBA) Mäuse mit 400 H. polygyrus L3-Larven in 200 ul destilliertem Wasser durch orale Gabe (zurückhalten Mäuse in aufrechter Position durch das Genick des Halses und sanft passieren die stumpfe Sondennadel durch den Mund und Speiseröhre in den Magen). Gut geschüttelt, vor jeder Infektion (Larven begleichen schnell in Wasser) und saugen Sie 200 ul in einer 1 ml Spritze; einen dedizierten Sondennadel mit einem abgerundeten Ende. Für experimentelle Infektion von jüngeren Mäuse (6-8 Wochen alt) oder anderen Inzuchtstämme (z C57BL / 6 oder BALBc) infizieren Mäuse mit 200 L3 Larven. </li></ol> 2. Vermehrung und Pflege von H. polygyrus <ol><li> Zeigen Kohle in der Mitte eines großen Kunststoffwanne und lassen kaltes Leitungswasser, um über sie für mindestens 30 Minuten laufen (ungewaschen Aktivkohle ist giftig für L3-Larven). Lassen Sie das Wasser aus der Wanne und legen Sie die Holzkohle auf two saugfähiges Papier legen, so dass es bis zur vollständigen Trocknung der Raumluft ausgesetzt. </li><li> Wenn Eier erforderlich sind, kratzen Kot zuerst aus dem Dickdarm mit einer Pinzette (und Schere falls erforderlich). Wenn eine große Anzahl von L3-Larven erforderlich ist, platzieren Mäuse auf einem Drahtgitter und sammeln Kotpillen über mehrere Tage. </li><li> Mischen Sie die Fäkalien mit granulierte Aktivkohle bei einem Verhältnis von mindestens 1: 1, um eine Konsistenz zu erreichen nur feucht genug, um sich an Filterpapier. Schmieren Sie eine dünne Schicht auf der Mitte von etwas angefeuchteten Filterpapier in einer Petrischale und legen Sie diese in einer feuchten Box (fügen Sie einige feuchten Papiertuch und eine Schüssel mit Wasser) im Dunkeln für 12-14 Tage. </li><li> Entfernen L3-Larven von Tag 7 ab, und sammeln sie auf mindestens zwei Gelegenheiten, bevor das Papier wird verworfen. Die Larven bilden einen Ring rund um den Rand des Filterpapiers; Heben Sie das Filterpapier aus der Petrischale und spülen Sie die Larven, die der Platte gelassen werden (mit einer Pipette und 5 ml sterilem Wasser pro Platte) in einen 50-ml-Tube. </li><li> AufzugAus dem Filterpapier und ernten die restlichen Larven links auf der Platte mit destilliertem Wasser in einen 50-ml-Tube. Zentrifugieren Sie die abfließende Lösung bei 300 g für 10 min. Dreimal Waschen Sie die Larven mit destilliertem Wasser und dann bei 4 ° C lagern in bis zu 50 ml destilliertem Wasser, bis sie benötigt. HINWEIS: Die Larven bleiben lebensfähig und infektiös für mindestens 6 Monate. </li></ol> 3. Sammlung von Adult H. polygyrus Worms <ol><li> Bereiten Sie die modifizierten Baermann Apparat im Voraus, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Cull Mäusen 14 Tage nach der Infektion. </li><li> Den Unterleib mit 70% Ethanol waschen. Schneiden Sie die Haut über den Bauch und ziehen Sie, um die vordere Bauchwand zu offenbaren. Stellen Sie Mittellinienschnitt, um die Bauchhöhle gelangen. </li><li> Nehmen Sie den gesamten Dünndarm und Dickdarm (Duodenum von proximal nach distal Rektum). Zeigen in eine trockene Petrischale. </li><li> Richten Sie den Darm über ihre gesamte Länge; Verbrauchsteuern die Fäkalien haltige Dick; legen Sie diese in eine separate Schüssel für Eierzubereitungen später. </li><li> Zuschneiden die proximalen 20 cm des Dünndarms, die die adulten Würmer von der relativ dicken Wand des Duodenums und oft eine rote Erscheinungsbild -identified aufgrund der intraluminalen Würmer enthält. In eine (Durchmesser 100 mm) Petrischale mit 5 ml Hanks-Lösung, erwärmt auf 37 ° C (zwei Exemplare pro Schale). </li><li> Öffnen Sie den Wurm-gefüllte proximalen Darmteil in Längsrichtung mit einer Schere (rund digen Schere sind am besten für diese), und kratzen im Inneren der Darmschleimhaut mit zwei Glasobjektträger um die Würmer zu entfernen. Dann werfen Sie die saubere Darmwand. </li><li> Tipp Würmer in kleine Musselin Taschen, Klammer geschlossen und mit Büroklammern um den Rand des Glastrichters (Abbildung 1). </li><li> Füllen Trichter mit Hanks-Lösung, geben Sie ca. 4 Petrischalen von Würmern in jeden Trichter. </li><li> Platz Gerät in 37 ° C-Inkubator für 1-2 h, Rühren sanft auf halbem Weg durch, um zu verdrängenSchmutz aus dem Darm Vorbereitung, die den Musselin Filter verstopfen können. Achten Sie darauf, um das Auslaufen von Schutt außerhalb des Musselinbeutel zu vermeiden - das wird eine Verunreinigung des letzten HES Vorbereitung verursachen. Erwachsene Würmer sollten langsam durch das Baumwolltuch migriert und an der Unterseite des Glasteströhrchen angesiedelt haben. Entfernen Sie vorsichtig das Reagenzglas aus dem Verbindungsgummischlauch über dem Waschbecken (dabei darauf achten, nicht zu verlieren Würmer an dieser Stelle). </li><li> Mit einem Kunststoff Pipette die Würmer in einen 50-ml-Tube und waschen sechsmal mit Hanks-Lösung (erlauben Würmer mit der Schwerkraft mit einer Stripette niederzulassen, zu entfernen Medien, 40 ml Hanks-Lösung, und wiederholen Sie fünf Mal). HINWEIS: Wurm Kultur muss ab diesem Zeitpunkt steril gehalten werden. <ol><li> Gehen Sie zu einer Steril und waschen weitere sechs Mal in steriler Hanks-Lösung mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, bereit für die in-vitro-Kultur ergänzt. </li></ol></li><li> Zählen Sie dieerwachsenen Würmer, indem man zwei Proben von 20 ul mit einer gelben Spitze cut ergriffen, um ihre Öffnung zu erweitern erholt; erwarten, etwa 50% der Menge des inokulierten Larven. </li></ol> 4. Einrichten Kulturen für HES: Medium Vorbereitung, Waschen Erwachsene Worms <ol><li> Weichen die Würmer von 3,11 in etwa 10 ml RPMI, ergänzt mit 10% Gentamycin für 20 Minuten, so dass die Röhre ruht in einem Winkel, um sicherzustellen, Würmern vollständig abgedeckt werden. </li><li> Führen Sie diese in einer Steril: nachwaschen sechsmal mit Hanks-Lösung (ergänzt mit 5 U / ml Penicillin und 5 ug / ml Streptomycin). </li><li> Bereiten H. polygrus Medien. </li><li> Die Aufrechterhaltung der Sterilität in einem Abzug mit laminarer Strömung, um 500 ml des RPMI1640 Fügen 11,1 ml 45% Glukose (Endkonzentration 1,2% RPMI1640 enthält 0,2% Glucose), 5 ml 100x Peniclllin-Streptomycin (Endkonzentration 5 U / ml Penicillin, 5 &amp; ​​mgr; g / ml Streptomycin) versetzt, 5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 2 mM), und5 ml Gentamycin (Endkonzentration 1%). Sie FCS hinzufügen nicht. </li><li> Aliquoten Würmer in entlüftet T25-Kolben, ca. 1.000 Würmer in 15 ml H. polygyrus Medien pro Kolben und Ort aufrecht in 37 ° C-Inkubator (5% CO 2) für 3 Wochen. </li></ol> 5. Herstellung von HES <ol><li> Sammeln HES haltigen Kulturmedien aus Kulturen in Abständen von nicht mehr als zweimal pro Woche, die Aufhebung der ersten Kollektion nach 24 Stunden der Kultur (durch den hohen Grad der LPS Verschmutzung und Wirtsproteinen - getrennt verarbeitet oder verworfen werden). Halten Sie jede Sammlung getrennt und deutlich mit dem Datum und Chargennummer versehen. Ersetzen Sie mit dem gleichen Volumen von H. polygyrus Medium auf jeder Gelegenheit. </li><li> Zentrifuge HES haltigen Medien bei 400 x g für 5 min. Dann filtern sterilisieren durch 0,2 um niedrige Proteinbindung Filter in 50 ml Tuben. Shop in der -20 ° C Gefrierschrank deutlich mit Datum der Wurm Ernte und das Datum der HES c gekennzeichnetollektion. </li><li> Nach 21 Tagen der HES Sammlung von Kultur, verwerfen Würmer. </li><li> Pool 500-1.000 ml HES Überstand (in der Regel aus der Tiefkühl, und nicht die, die die erste 24-Stunden-Sammlung) und einen 3.000 MWCO-Filter in der Ultrafiltrationsvorrichtung zu konzentrieren auf unter Stickstoffdruck. HINWEIS: Achten Sie sorgfältig darauf, den Filter trocken laufen lassen. <ol><li> So richten Sie das Filtergerät, zuerst die 3 kDa Membran glänzende Seite in einem 1-Liter-Becher sich gründlich mit destilliertem Wasser für 3 x 20 Minuten unter Rühren. Montieren Sie die Ultrafiltrationsvorrichtung nach Angaben des Herstellers mit Filtermembran glänzenden Seite nach oben. Platz im Schrank bei 4 ° C erwärmt und 50 ml destilliertem Wasser durch, bevor Sie sich auf die Sammel HES konzentrieren. </li><li> Fügen jedes Rohr von HES in die Filtrationsvorrichtung nach Bedarf (100-140 ml pro Tag), bis das Volumen 2-5 ml eingeengt wird. </li></ol></li><li> Um Verunreinigungen von der HES-enthaltende Kulturmedien zu entfernen, 50 ml pyr hinzufügenogen freien PBS zu der Filtervorrichtung und dann konzentrieren sich auf ca. 2 ml. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal (150 ml PBS insgesamt). Übertragen HES in einen 15-ml-Röhrchen, filtersterilisieren (mit einem 0,2-um-Filter) in einer Haube mit laminarer Strömung und Messen der Proteinkonzentration unter Verwendung eines Spektrophotometers (E 280 = 10) oder mit dem Bradford-Assay. </li><li> Aliquot, Label mit Chargennummer und das Datum und die Gefriert bei -80 ° C. </li><li> Führen eines chromogenen LAL Assay nach den Protokollen des Herstellers für jeden Ansatz durch HES vor der Verwendung. Wenn LPS Niveau von größer als 1 U LPS pro 1 ug Protein sind, sollten Sie nicht mit dieser Charge für in vivo-Experimenten oder in vitro-Kulturen. </li><li> Verarbeiten Sie die bei 24 Stunden getrennt in der gleichen Art und Weise gesammelt HES; es wird LPS und einige Wirtsproteine ​​enthalten und, obwohl sie nicht für verschiedene Experimente ist es eine nützliche Quelle von einzelnen Molekülen, die durch den monoklonalen Antikörper der Affinitätsreinigung isoliert werden kann. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

Der Lebenszyklus von H. polygyrus Erlöse in einer konsistenten Art und Weise zuverlässig. Nach Natur Verschlucken oder orale Gabe von L3-Larven am Tag 0, beginnen Zysten unter der Zwölffingerdarm-Serosa von Tag 5 zu bilden, voran zu Larven Häutungen und Schwellenländern als erwachsenen Würmer in das Darmlumen von Tag 10, können Eier im Kot aus gesehen werden Tag 14 und Granulome auf der duodenalen Serosaoberfläche von Tag 21. Die oben beschriebenen (und in Figur 6 zusammengefaßt) -Protokoll sichtbar ermöglicht Produktion mit hohem Durchsatz von H. polygyrus Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES), zusätzlich zum zuverlässigen Wiederherstellung lebensfähiger L3-Larven für zukünftige experimentelle und Lebenszyklus-Infektionen. H. polygyrus Infektion hat sich gezeigt Schutz in Modellen von Asthma abhängig von OVA oder Der p 1 (Hausstaubmilben-Allergen) 14 sein. Darüber hinaus könnte die Unterdrückung der Atemwegsentzündung mit CD4 + CD25 + übertragen werden </sup&gt; regulatorischen T-Zellen 14 oder CD19 + CD23 hallo regulatorischen B-Zellen 24 aus nicht-sensibilisierten, H. polygyrus infizierten Mäusen. Bei den Modellen der Autoimmunität, H. polygyrus Infektion wurde gezeigt suppressive in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell von Multipler Sklerose 9 zu sein, und die Unterdrückung kann entweder mit CD4 + T-Zellen oder CD19 + B-Zellen aus infizierten Mäusen 24 übertragen werden. Heligmosomoides polygyrus Ausführungs sekretorischen Produkten (HES) modulieren die Immunantwort des Wirts und Th2-vermittelte Entzündung unterdrücken, indem eine Reihe von Mechanismen (in Abbildung 7 beschrieben), einschließlich: a) Hemmung der dendritischen Zellen gegenüber Stimulation 25, b) Induktion von CD4 + Foxp3 + regulatorischen T-Zellen 18. und c) die Blockierung von IL-33 Produktion 20. HES hat sich gezeigt, schützend zu sein, wenn sie verabreicht eint Sensibilisierung oder Herausforderung in der OVA-Alaun-Modell von Asthma 19 und auch, wenn intranasal mit Alternaria Extrakt Allergen 20 verabreicht, durch Unterdrückung der frühen IL-33 Freisetzung. Vermeidung der LPS Kontamination von HES ist oft von entscheidender Bedeutung für den Erfolg der Zukunft immunologischen Experimenten. Im Protokoll hier skizzierten die kritischen Schritte bei der Erreichung dieses sind, dass innerhalb der Musselin Taschen der Baermann Gerät nicht in die endgültige HES Zubereitung enthaltenen Schmutz zu gewährleisten (siehe 2.10) und zur Seite zu ES-Lösung aus der ersten 24 Stunden der Kultur gesetzt (siehe 5.1). In den letzten Jahren HES wurde gründlich an der Proteom-Ebene mit mehr als 370 identifiziert 26,27 unterschiedliche Proteine ​​aus. Darüber hinaus hat ES aus dem 4. Larvenstadium zu Proteomanalyse 28 unterzogen. Laufende Arbeiten Charakterisierung der Hauptkomponenten von Glycan HES bekannte stark immunogen 3 zu sein, und sezernierten Mikro RNWie die in 50 bis 100 nm Bläschen oder Exosomen (Buck et al., Zur Publikation eingereicht) gekapselt. Mit der Gründung der reproduzierbaren Protokolle für die Sammlung von ES aus diesem hoch immunmodulatorische Parasiten und mit umfangreichen proteomische Daten zur Identifizierung der molekularen Komponenten von HES ist die Bühne nun für die Identifizierung und therapeutische Prüfung einzelner Moleküle aus H. eingestellt polygyrus die Schlüssel Auswirkungen auf das Immunsystem des Wirts zu vermitteln können.

Heligmosomoides polygyrus ist ein natürlicher Maus-Magen-Darm-Helminthen, die eng mit hoch vorherrschende menschliche Nematodparasiten 1 verbunden ist. Im Gegensatz zu anderen Nematoden Modelle wie Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus konsequent stellt eine chronische Infektion in Mäusen als eine direkte Folge von mehreren leistungsstarken immunmodulatorische Mechanismen beschäftigt, um die Immunantwort des Wirts 2 zu unterdrücken. H. polygyrus hat einen direkten Lebenszyklus: infektiösen L3-Larven werden von feco-orale Übertragung aufgenommen (oder durch orale Gabe in der Laborumgebung verabreicht), worauf sie wandern zum subseröse Schicht des Zwölffingerdarms und encyst vor der Rückkehr in das Darmlumen als erwachsenen Würmer etwa acht Tage nach der ersten Infektion. Paarung und Eierproduktion tritt am Tag 10 und es ist möglich, adulte Würmer für Kultur und Sammlung von Ausscheidungs-sekretorischen Produkte da ernteny 14 ab 3. H. polygyrus interagiert auch mit der kommensalen Mikroflora, mit erhöhter Milchsäurebakterien vorhanden in infizierten Mäusen anfällig 4-6, und ein höheres Maß an H. polygyrus Infektion nach Exposition von Mäusen auf Laktobazillen 6. Aktive Infektion mit H. polygyrus wurde gezeigt, dass gegen Immunpathologie in vielen Tiermodellen für Autoimmunität 7-10 schützen, Colitis 11,12 und Allergien 13-16. Daher gab es großes Interesse an dem Potenzial der Ausscheidungs-Sekretorische Moleküle aus diesem Parasiten (&quot;HES&quot;), um nach unten zu modulieren Pathologie in vivo 17,18. Tatsächlich werden schützende Wirkung nach der Behandlung der Mäuse mit HES-Produkte 19 über Pfade, die jetzt identifiziert 18,20 ersichtlich. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die zuverlässige Herstellung von Heligmosomoides polygyrus und Wiederherstellung ihrer abgesondert Produktedaß weiter eine Reihe von funktionellen biochemische und immunologische Untersuchungen verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (früher Nematospiroides dubius bekannt und auch von einigen als H. bakeri bezeichnet) ist ein gastrointestinaler Helminthen, die mehrere immunmodulatorische Mechanismen einsetzt, um eine chronische Infektion in Mäusen herzustellen und ähnelt vorherrschenden menschlichen Wurminfektionen. H. polygyrus wurde ausgiebig auf dem Gebiet der Wurm abgeleitete Immunregulation studiert und hat sich als potent drücken experimentellen Modellen von Allergie und Autoimmunität (beide mit einer aktiven Infektion und isoliert abgesondert Produkte). Die in diesem Papier beschriebene Protokoll beschreibt Verwaltung des H. polygyrus Lebenszyklus für eine konsistente Produktion von L3-Larven, die Verwertung von erwachsenen Parasiten und Sammlung ihrer Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES).

Die Anfälligkeit für eine Infektion mit H. polygyrus wird zu einem großen Teil durch den genetischen Hintergrund der Mausstamm (Tabelle 1) gesteuert wird; C57BL / 6 und CBA-Mäusen sind sehr anfällig 21,22. Für die Versorgung der Lebenszyklus des Parasiten hat die F1-Hybride zwischen diesen beiden Stämmen für seine Fähigkeit, sehr viel höher Wurmlast ohne Morbidität (übermäßige Darmepithelzellen Schäden) zu widerstehen, verglichen mit entweder Elternstamm ausgewählt. Oralsonde 400 L3 Larven wird der Lebenszyklus in F1-Mäuse zu erhalten (was zu Erwachsenen in 2 gezeigt Wurmlast), während eine Dosis von 200 L3 Larven wird allgemein für Experimente bei homozygoten Inzuchtstämmen (beispielsweise C57BL / 6 verwendet oder BALBc). Allerdings müssen diese Dosierung kann je nach Umgebungs Cofaktoren, die zwischen Tierhaltung, wie Schwankungen der Darmflora unterscheiden können reduziert werden. Chargen von HES haben reproduzierbare effi bewährtsamkeit in funktionellen Assays und Protein-Zusammensetzung; Außerdem, wenn Überstände von jedem aufeinanderfolgenden Woche Kultur wurden analysiert, bis zu insgesamt 4 Wochen wurden die Proteinprofile gefunden, sehr ähnlich (Figur 3). Wenn HES Konzentration wird mittels Bradford-Test gemessen (siehe 5.5) werden die Gesamt Protein ist in der Regel etwa 1 mg / ml (Figur 4). Ein alternatives Verfahren zum Konzentrieren von HES mit einem Zentrifugenkonzentrator (zB Vivaspin 3 kDa cut-off Membran), in denen die Proben werden auf bis zu 4.000 g in einem Ausschwingrotor Zentrifuge, Entfernen Puffersalze und niedrigmolekulare Bestandteile. Kreisel Konzentration ist am besten für kleine Verarbeitungsmengen (1-10 ml) geeignet und sind auf eine maximale Konzentration etwa den Faktor 30x begrenzt. Beim Sammeln von HES, ist die Vermeidung der Kontamination von entscheidender Bedeutung. Um eine Kontamination mit Gastmolekülen zu vermeiden, entsorgen wir HES-containing Kulturmedien von der ersten 24 Stunden nach der erwachsene Wurm Ernte aus dem Mausdarm. Wir die Höhe der LPS Verschmutzung quantifizieren auch in jeder Charge von HES mit einem chromogenen LAL-Test (siehe 5.7). 1 U LPS entspricht ~ 100 pg LPS und Ebenen darunter werden als vernachlässigbar angesehen 23. In unseren Händen, die meisten Partien von HES deutlich unter dieser Grenze, die mittlere Konzentration von LPS in HES als 0,23 U / ug (Abbildung 5). Die Wirkungen von LPS in in vivo-Modellen der Pathologie (zum Beispiel die Unterdrückung von asthmatischen Reaktionen) benötigt mindestens 10 ng LPS 23. Daher in vivo-Verabreichung von 5 ug HES aus einer Charge mit 100 pg LPS / ug HES umfasst 500 pg LPS deutlich unter die effektive Konzentration in dem LPS zu einem Problem. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Baermann Apparat BaerMann Versuchsaufbau für die Sammlung von Erwachsenen H. polygyrus (wie in Kapitel 2 beschrieben). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Mittlere Worm Burden 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3 Larven Mittlere Wurm belastet 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3-Larven. Gezeigten Datenpunkte sind aus 19 separaten Runden der Infektion von C57BL / 6xCBA Mäusen. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Proteinprofile von HES aus aufeinanderfolgenden Wochen in Kultur SDS-PAGE-Profil von HES-Proteine ​​in aufeinander folgenden Wochen der Kultur gesammelt. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: </strong&gt; Endmenge von HES 500 ml ES-haltigen Medien Die Ausbeute an HES-Protein aus 11 verschiedenen Chargen von ca. 500 ml Kulturüberstand stammt. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Abbildung 5: LPS Kontamination von HES Ebenen LPS Kontamination in 41 Chargen von HES durch die Limulus ameobocyte Assay gemessen. Median LPS-Konzentration = 86 U pro mg HES. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Abbildung 6: Schematische Darstellung der Animated H. polygyrus Lebenszyklus Zusammenfassung der wichtigsten Phasen des Lebenszyklus von orale Gabe von L3-Larven, durch Rückgewinnung von Larven und erwachsenen Würmer zu Isolierung von HES. Abbildung 7: Schematische Darstellung der Animated HES und ihre Funktionen Taste immunmodulatorische Effekte von in HES enthaltenen löslichen Mediatoren und Exosomen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype (und Hintergrund Stamm) </td><td> Primäre Infektion Phänotyp </td><td> Hinweis </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inzuchtstämmen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 und C57BL / 10 </td><td> Anfällig </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Zwischen- </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Geringe Empfindlichkeit </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für Cytokine oder Cytokinrezeptoren </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Weniger anfällig (a); keine Änderung in der Empfindlichkeit, sondern erhöht Granulome (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2R &amp; beta; Transgenic (C57BL / 6) </td><td> Beständig </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R-- / - (C57BL / 6 und BALB / c) </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c oder C57BL / 6) </td><td> Highly Resistant </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 Transgenic(FVB) </td><td> Beständig </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Mangel Th2, verringert Granulom gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Keine Veränderung der Empfindlichkeit </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Hohe Th1, Erhöhte Anfälligkeit </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für die T-Zell-Marker </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Geringfügig höheren Fruchtbarkeit </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für angeborene Immun loci </td><td></td></tr><tr><td> Typ-1-Interferon-Rezeptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Widerstandsfähiger, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Anfälliger </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Primäre Infektion mit H. polygyrus in genetisch unterschiedliche und gezielte Gen-Mausstämme.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

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