Name: cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה מבוצעת בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי משרד בית אנגליה ואוניברסיטת השירותים הווטרינריים אדינבורו. 1. זיהום של עכברים על ידי Gavage <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות זחלי Heligmosomoides polygyrus L3 במים מזוקקים עד שישה חודשים על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, לשטוף זחלי L3 שלוש פעמים במים מזוקקים: צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות (עם בלם), להסיר את כל אבל 500 μl של מים (כדי למנוע זחלי L3 טבליות מטרידים) וresuspend גלולה בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטיפה השלישית, מוסיף מים עד לנפח מדויק (בדרך כלל 40 מיליליטר) ולשאוב 20 μl עם חתך טיפ 200 μl להרחיב צמצמה. מניחים שתי 20 דגימות μl על פני השטח של צלחת תרבות 60 מ&quot;מ ולספור את זחלי L3 (בדרך כלל ניידת, ונראה במיטבו תחת 50X הגדלה עם מיקרוסקופ לנתח). Resuspend גלולה הסופיים במים מזוקקים לconcentration של 2,000 זחלי L3 לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצור מעגל חיים, להדביק (C57BL / 6xCBA) עכברים 8 שבועות בן F1 עם 400 H. זחלי polygyrus L3 ב 200 μl של מים מזוקקים על ידי gavage האוראלי (לרסן את העכברים במצב הזקוף בעורף ובעדינות להעביר את מחט gavage הבוטה דרך הפה והוושט לקיבה). להתסיס ביסודיות לפני כל זיהום (זחלים ליישב במהירות במים) ולשאוב 200 μl במזרק 1 מיליליטר; להשתמש במחט gavage ייעודית עם קצה מעוגל. לזיהום ניסיון של עכברים צעירים (6-8 שבועות), או זנים טהורים אחרים (למשל C57BL / 6 או BALBc), להדביק עכברים עם 200 זחלי L3. </li></ol> 2. רביה ותחזוקה של H. polygyrus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פחם במרכז אמבטיה פלסטיק גדול ומאפשר למים ברז קרים לדרוס אותו למינימום של 30 דקות (לא רחוץ פחם פעיל הוא רעיל לזחלי L3). מסננים את המים מהאמבטיה ולמקם את הפחם על tוו שכבות של נייר סופג, והשאירו אותו חשוף לאוויר חדר עד יבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצים נדרשות, לגרד צואה הראשונה מתוך המעי הגס עם מלקחיים (ומספריים במידת צורך). אם יש צורך במספר גדול של זחלי L3, מקום עכברים על רשת תיל ולאסוף כדורי צואה על פני כמה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הצואה עם פחם מגורען ביחס של לפחות 1: 1, כדי להשיג עקביות פשוט רטוב מספיק כדי לדבוק לסנן נייר. למרוח שכבה דקה על המרכז של כמה נייר סינון לח בצלחת פטרי ומניח את זה בתיבה לחה (להוסיף קצת נייר מגבת לחה וקערת מים) בחושך במשך 12-14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר זחלי L3 מיום 7 ואילך, ולאסוף אותם, לפחות בשתי הזדמנויות לפני שהנייר שהושלך. הזחלים יוצרים טבעת מסביב לקצה של נייר הסינון; הרם את נייר הסינון מצלחת פטרי ולשטוף את הזחלים שנשארו מהצלחת (בעזרת פיפטה ו -5 מיליליטר של מים סטריליים לכל צלחת) לתוך צינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Liftאת נייר הסינון ולאסוף את הזחלים שנותרו נשארו בצלחת עם מים מזוקקים לתוך צינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה פתרון השפכים ב XG 300 עבור 10 דקות. שטוף את הזחלים שלוש פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס בעד 50 מיליליטר של מים מזוקקים עד נדרשת. הערה: הזחלים להישאר קיימא ומזהם במשך לפחות 6 חודשים. </li></ol> 3. אוסף של H. מבוגרים התולעים polygyrus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשירי Baermann שונה מראש, כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים ללקט ארבע עשרה ימים לאחר ההדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבטן עם אתנול 70%. חותך את העור מעל הבטן ולמשוך בחזרה כדי לחשוף את דופן הבטן הקדמית. לעשות חתך קו האמצע כדי להיכנס לחלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעי כולו קטן וגדול (מתריסריון הפרוקסימלי לרקטום דיסטלי). הנח לצלחת פטרי יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הבטן לכל אורכו; בלו מעי גס צואה המכיל; את המקום הזה לצלחת נפרדת להכנות ביצה מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו 20 סנטימטרים הפרוקסימלי של מעי דק שמכיל את התולעים בוגרות -identified על ידי הקיר העבה יחסית של התריסריון, ולעתים קרובות מראה אדום בשל תולעי התוך luminal. הנח לתוך צלחת פטרי (100 מ&quot;מ קוטר) עם 5 מיליליטר של הפתרון &#39;הנקס, חימם עד 37 ° C (שתי דגימות לכל צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלק מעי הפרוקסימלי מלא תולעת longitudinally עם מספריים (מספריים הסתיימו עגולים הם הטובים ביותר לכך), ולגרד את החלק הפנימי של מעי בטנה עם שתי שקופיות זכוכית כדי להסיר את התולעים. ואז להשליך את קיר הבטן הנקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעי טיפ לשקיות מוסלין קטנים, מצרך סגור ובטוח עם מהדקים מסביב לקצה של משפך הזכוכית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא משפך עם הפתרון &#39;הנקס ולהוסיף כ 4 צלחות פטרי של תולעים לכל משפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון מקום 37 ° C חממה במשך 1-2 שעות, בעדינות להסעיר חצי דרך כדי לסלקפסולת ממעי ההכנה שעשויה לחסום את מסנן המוסלין. תשמור על עצמך, כדי למנוע דליפה של פסולת מחוץ לשקית המוסלין - זה יגרום זיהום של הכנת הס הסופית. צריכה היגרו תולעים בוגרות באיטיות דרך בד המוסלין והתיישבו בחלק התחתון של מבחנת זכוכית. לנתק בזהירות את המבחנה מצינור גומי חיבור מעל הכיור (טיפול כדי למנוע אובדן של תולעים בשלב זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את התולעים לתוך צינור 50 מ&quot;ל ולשטוף שש פעמים עם הנקס &#39;פתרון (לאפשר תולעים להתיישב עם כוח הכבידה, להסיר תקשורת עם stripette, להוסיף 40 מיליליטר של הנקס&#39; הפתרון וחזור חמש פעמים). הערה: תרבות תולעת חייבת להישמר סטרילי מנקודה זו ואילך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לזרימה למינרית ולשטוף עוד שש פעמים בפתרון &#39;הנקס סטרילי בתוספת 100 U / ml פניצילין ושל 100 מק&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, מוכן לתרבות במבחנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזןתולעים בוגרות התאוששו על ידי לקיחת שתי דגימות של 20 μl נלקח עם קיצוץ קצה צהוב להרחיב צמצמה; מצפה כ -50% מהכמות של זחלים מחוסן. </li></ol> 4. הגדרת תרבויות להס: הכנה בינונית, כביסה תולעים בוגרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את התולעים מ3.11 בכ 10 מיליליטר של RPMI בתוספת 10% gentamycin במשך 20 דקות, והשאיר את מנוחת הצינור בזווית כדי להבטיח תולעים מכוסים במלואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את זה בזרימה למינרית: לשטוף שוב שש פעמים עם הפתרון &quot;הנקס (בתוספת 5 U / ml פניצילין ו5 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן H. תקשורת polygrus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על סטריליות בזרימה למינרית מכסה המנוע, 500 מיליליטר של RPMI1640, להוסיף 11.1 מיליליטר של 45% גלוקוז (ריכוז סופי 1.2% כRPMI1640 מכיל גלוקוז 0.2%), 5 מיליליטר של 100x Peniclllin סטרפטומיצין (ריכוז סופי 5 U / ml פניצילין, 5 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר), 5 מיליליטר של L-גלוטמין (ריכוז סופי 2 מ&quot;מ), ו5 מיליליטר של gentamycin (ריכוז סופי 1%). אל תוסיף FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעי Aliquot לתוך צלוחיות T25 פרקו, כ. 1,000 תולעים בH. 15 מיליליטר תקשורת polygyrus לכל בקבוק, ומקום זקוף ב -37 חממת ° C (5% CO 2) במשך 3 שבועות. </li></ol> 5. הכנת הס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף הס המכיל תקשורת ותרבות מתרבויות במרווחים של לא יותר מפעמיים בשבוע, להניח בצד את האוסף הראשון לאחר 24 שעות של התרבות (עקב רמות גבוהות של זיהום LPS וחלבוני מארח - יכול להיות מעובד בנפרד או שהושלך). שמור כל איסוף נפרד ומסומן עם מספר התאריך ויצווה בבירור. החלף עם נפח שווה של H. תקשורת polygyrus בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הס המכיל תקשורת ב 400 x גרם במשך 5 דקות. אז לסנן לעקר באמצעות 0.2 מיקרומטר מסננים דל חלבון מחייב לצינורות 50 מיליליטר. חנות ב-20 ° C במקפיא שכותרתו עם תאריך של קציר תולעת ותאריך ג הס ברורollection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 21 ימים של אוסף הס מתרבות, להשליך תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500-1,000 מיליליטר בריכה של supernatant הס (בדרך כלל ממניות קפוא, ולא כולל את אוסף שעות 24 הראשונים) ולהתרכז על מסנן 3,000 MWCO במכשיר אולטרה תחת לחץ חנקן. הערה: היה זהיר מאוד שלא לתת ליבש מסנן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את מכשיר הסינון, ראשון לשטוף את הצד המבריק 3 קרום kDa למטה בכוס 1 ליטר עם מים מזוקקים במשך 3 x 20 דקות תוך בחישה. להרכיב את מכשיר אולטרה סינון לפי הוראות יצרן עם קרום מסנן צד מבריק למעלה. מקום בארון על 4 מעלות צלזיוס ולהעביר 50 מיליליטר של מים מזוקקים דרך לפני שמתחיל להתרכז הס נקווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף צינור אחד של הס למכשיר הסינון כנדרש (100-140 מיליליטר ביום), עד הנפח מרוכז עד 2-5 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר מזהמים מכלי תקשורת התרבות הס המכיל, להוסיף 50 מיליליטר של PYRעוגן ללא PBS למכשיר הסינון ולאחר מכן להתרכז עד כ 2 מיליליטר. חזור על פעולה זו פעמיים (150 מיליליטר של PBS בסך הכל). העבר את הס לתוך צינור 15 מיליליטר, לעקר מסנן (עם מסנן 0.2 מיקרומטר) בזרימה למינרית ולמדוד ריכוז חלבון באמצעות ספקטרופוטומטר (E 280 = 10) או על ידי assay ברדפורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot, תווית עם מספר האצווה ותאריך, והקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay LAL chromogenic על פי הפרוטוקולים של היצרן על כל אצווה של הס לפני השימוש. אם רמות LPS הן גדולות מ -1 U LPS חלבון 1 מיקרוגרם ל, לשקול לא באמצעות אצווה זה לin vivo ניסויים או בתרבויות חוץ גופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הס שנאסף ב 24 שעות בנפרד באותו אופן; הוא יכיל LPS וכמה חלבוני מארח ו, ואילו אינו מתאים לניסויים פונקציונליים, היא מהווה מקור שימושי של מולקולות בודדות שעשויים להיות מבודדת על ידי טיהור זיקת נוגדן חד שבטי. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

מחזור החיים של H. תמורת polygyrus באופן מהימן ועקבי. בעקבות בליעה טבעית או gavage פה של זחלי L3 ביום 0, ציסטות מתחילות להיווצר מתחת לserosa התריסריון ביום 5, התקדמו לmoults זחל ולאחר מכן מתעוררות כמו תולעים בוגרות לתוך לום הבטן מיום 10, ניתן לראות ביצים בצואה מ יום 14 וגרנולומות גלויים על פני השטח serosal התריסריון מיום 21. הפרוטוקול שתואר לעיל (ומסוכם באיור 6) מאפשר לייצור תפוקה גבוהה של ח מוצרי polygyrus הפרשה-הפרשה (הס), בנוסף להתאוששות אמינה של זחלי L3 קיימא לזיהומי מחזור ניסיוניים וחיים בעתיד. זיהום polygyrus H. הוכח להיות מגן במודלים של אסתמה תלויות בOVA או Der p 1 (אלרגן קרדית אבק הבית) 14. יתר על כן, דיכוי הדלקת בדרכי אוויר יכול להיות מועבר עם CD4 + CD25 + </sup&gt; תאי T רגולטורים 14 או CD19 + CD23 תאי B רגולציה היי 24 מאינם רגישים, ח &#39; polygyrus -infected עכברים. במודלים של אוטואימוניות, ח &#39; זיהום polygyrus הוכח להיות מדכא במודל הניסויי Encephalomyelitis אוטואימוניות (EAE) של טרשת נפוצה 9, ודיכוי ניתן להעביר גם עם תאי CD4 + T או CD19 + B תאים מעכברים נגועים 24. חומרי ההפרשה-הפרשה polygyrus Heligmosomoides (הס) לווסת את התגובה החיסונית המארחת ולדכא דלקת בתיווך Th2 על ידי מספר המנגנונים (שמתוארים באיור 7), ובם: א) עיכוב של היענות תאים דנדריטים לגירוי 25, ב ​​אינדוקציה) של CD4 תאים + Foxp3 + רגולציה T 18. וג) מצור של IL-33 ייצור 20. הס הוכח להיות מגן כאשר מנוהלרגישות t או אתגר במודל OVA-אלום של אסטמה 19 וגם כאשר מנוהל intranasally עם האלרגן תמצית Alternaria 20, דרך דיכוי של IL-33 שחרור מוקדם. הימנעות מזיהום LPS של הס היא לעתים קרובות חיונית להצלחה של ניסויים חיסוניים עתיד. בפרוטוקול שתואר כאן, השלבים הקריטיים בהשגת מטרה זו הם להבטיח כי פסולת הכלול בתוך שקיות המוסלין של מכשירי Baermann לא נכנס להכנת הס הסופית (ראו 2.10) ולהניח בצד את פתרון ES מהשעה 24 הראשונה של תרבות (ראה 5.1). בשנים האחרונות, הס התאפיין ביסודיות ברמת proteomic עם מעל 370 חלבונים שונים זיהו 26,27. בנוסף, ES מזחלי שלב 4 כבר נתון לניתוח proteomic 28. עבודה שוטפת כוללת אפיון הרכיבים העיקריים של סוכרי הס, ידועים להיות מאוד חיסוני 3, ומופרשת מיקרו-RNשכגלומים 50-100 ננומטר שלפוחית ​​או exosomes (Buck et al., הוגשה לפרסום). עם הקמתה של פרוטוקולים לשחזור לאיסוף ES מטפיל המערכת החיסונית הזה מאוד, ועם נתונים proteomic נרחבים זיהוי הרכיבים המולקולריים של הס, השלב מוגדר כעת לזיהוי והבדיקה רפואית של מולקולות בודדות מH. polygyrus שיכול לתווך השפעות מרכזיות על המערכת החיסונית המארח.

polygyrus Heligmosomoides הוא helminth עיכול עכברי טבעי הקשור באופן הדוק לטפילי נמטודות אדם מאוד-נפוצים 1. בניגוד לדגמים אחרים, כגון נמטודות Nippostrongylus brasiliensis, ח &#39; polygyrus קובע באופן עקבי זיהום כרוני בעכברים כתוצאה ישירה של מנגנוני המערכת החיסונית חזקה מרובים היא מעסיקה כדי לדכא את התגובה חיסונית המארח 2. יש polygyrus H. מחזור חיים ישיר: זחלי L3 מזהמים הם מעובדים על ידי העברת feco-שבעל-פה (או מנוהלים על ידי gavage האוראלי במעבדת ההגדרה), ואז הם נודדים לשכבת subserosal של התריסריון וencyst לפני ההחזרה ללומן המעי כ תולעים בוגרות שמונה כ ימים לאחר הדבקה ראשונית. ייצור הזדווגות והביצה מתרחש ביום 10 ואפשר לקצור תולעים בוגרות לתרבות ואוסף של חומרי הפרשה-הפרשה מday 14 3. ואילך H. polygyrus גם אינטראקציה עם מיקרופלורת commensal, עם לקטובצילוס המוגבר הנוכחית בעכברים נגועים רגישים 4-6, ורמות גבוהות של ח זיהום polygyrus בעקבות החשיפה של עכברים ללקטובצילוס 6. זיהום פעיל עם ח &#39; polygyrus הוכח כדי להגן מפני immunopathology במודלים של בעלי חיים רבים של אוטואימוניות 7-10, קוליטיס 11,12 והאלרגיה 13-16. כתוצאה מכך חל עניין רב בפוטנציאל של מולקולות טרמינל-הפרשה מטפיל זה (&quot;הס&quot;) ללמטה לווסת פתולוגיה in vivo 17,18. ואכן, השפעות מגנות נראות לאחר טיפול של עכברים עם מוצרי הס 19 דרך מסלולים אשר כעת עוברות זיהו 18,20. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצור אמין של polygyrus Heligmosomoides וההתאוששות של מוצרים המופרשיםשיכול להיות מנוצל נוסף עבור מגוון רחב של חקירות ביוכימיים וחיסוניות תפקודיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

polygyrus Heligmosomoides (שנקרא בעבר dubius Nematospiroides, וגם מכונה על ידי כמה כH. bakeri) הוא helminth עיכול שמעסיק מנגנוני המערכת החיסונית מרובים להקים זיהום כרוני בעכברים ובקירבת זיהומי helminth אנושיים נפוצים. H. polygyrus נחקר בהרחבה בתחום הרגולציה חיסונית הנגזר helminth וכבר מצא לדכא בעצמה מודלים ניסיוניים של אלרגיה ואוטואימוניות (שניהם עם מוצרים מופרשים מבודדים זיהום ופעיל). הפרוטוקול המתואר במאמר זה מתאר ניהול H. מחזור החיים polygyrus לייצור עקבי של זחלי L3, התאוששות של טפילים בוגרים, ואוסף של המוצרים שלהם ההפרשה-הפרשה (הס).

רגישות לזיהום עם ה &#39; polygyrus נשלט במידה רבה על ידי הרקע הגנטי של זן העכבר (טבלת 1); עכברי C57BL / 6 וCBA רגישים 21,22 מאוד. לתחזוקה של מחזור החיים טפילים, ההיברידי F1 בין שני זנים אלה נבחר ליכולתו לעמוד נטל תולעת הרבה יותר גבוה ללא תחלואה (נזק אפיתל במעי מוגזם) בהשוואה לאו מתח הורי. האוראלי gavage של 400 זחלי L3 משמש כדי לשמור על מחזור החיים בעכברי F1 (וכתוצאה מכך נטל תולעת בוגר שמוצג באיור 2), בעוד במינון של 200 זחלי L3 משמש בדרך כלל לניסויים בזנים טהורים הומוזיגוטים (למשל, C57BL / 6 או BALBc). עם זאת, מינון זה ייתכן שיהיה הצורך מופחת בהתאם לשיתוף גורמים סביבתיים שעלולות להיות שונה בין מתקני בעלי חיים, כגון שינויים בפלורת מעיים. קבוצות של הס הוכיחו אפי לשעתקcacy במבחנים פונקציונליים ובהרכב חלבון; יתר על כן, כאשר supernatants מכל שבוע של התרבות רצוף נותח, עד לסך של 4 שבועות, פרופילי החלבון נמצאו דומה מאוד (איור 3). כאשר ריכוז הס נמדד על ידי assay ברדפורד (ראה 5.5), הכולל חלבון הוא בדרך כלל כ 1 / מ&quot;ג מיליליטר (איור 4). שיטה חלופית של ריכוז הס היא עם רכז צנטריפוגלי (למשל קרום חתוך 3-kDa Vivaspin), שבו דגימות הם הסתחררו במהירות של עד 4,000 גר &#39;בצנטריפוגה הרוטור את נדנדה, הסרת מלחי חיץ ורכיבי משקל מולקולריים נמוכים. ריכוז צנטריפוגלי הוא מתאים ביותר לנפחים קטנים עיבוד (1-10 מיליליטר) ומוגבלים לגורם ריכוז מרבי של כ 30x. בעת איסוף הס, הימנעות מזיהום היא קריטית. כדי למנוע זיהום עם מולקולות מארח, אנחנו זורקים את הס-המשךaining תקשורת ותרבות מ24 שעות הראשונות לאחר קציר תולעת בוגר מהמעי העכבר. אנחנו גם לכמת את רמת זיהום LPS בכל אצווה של הס עם assay Chromogenic LAL (ראה 5.7). 1 U של LPS משווה ל ~ 100 pg LPS והרמות מתחת זה נחשבות זניח 23. בידיים שלנו, רוב קבוצות של הס באופן משמעותי מתחת לגבול זה, הריכוז הממוצע של LPS בהס להיות 0.23 U / מיקרוגרם (איור 5). ההשפעות של LPS במודלי in vivo של פתולוגיה (למשל דיכוי תגובות אסתמה) דורשת לפחות 10 ng של LPS 23. מכאן בממשל vivo של 5 מיקרוגרם הס מיצווה עם 100 pg LPS / מיקרוגרם הס יכלול 500 pg LPS, הרבה מתחת לריכוז היעיל בי LPS הופך לבעיה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> איור 1: מכשירי Baer Baermannהתקנת מכשירי מאן לאוסף של H. הבוגר polygyrus (כפי שתואר בסעיף 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> איור 2: ממוצע נטל תולעת 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 תולעת L3 זחלי Mean מכביד 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 זחלי L3. נקודות הנתונים המוצגות הן מ -19 סיבובים נפרדים של זיהום של עכברי C57BL / 6xCBA. ממוצע ± SEM מוצג. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> איור 3: פרופילי חלבון של הס משבועות רצופים בפרופיל SDS-PAGE תרבות של חלבוני הס שנאספו בשבועות רצופים של התרבות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> איור 4: </s<html> trong&gt; כמות סופית של הס מ -500 מדיה תשואה של חלבון הס מ -11 קבוצות שונות הנגזרות מכ -500 מיליליטר של supernatant התרבות המכיל ES מיליליטר. ממוצע ± SEM מוצג. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> איור 5: LPS זיהום של רמות הס של זיהום LPS ב 41 קבוצות של הס שנמדדו על ידי assay ameobocyte Limulus. ריכוז LPS חציון = 86 U למ&quot;ג של הס. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> איור 6: אנימציה סכמטי של H. סיכום polygyrus מחזור החיים של שלבי מחזור החיים של מפתח מgavage הפה של זחלי L3, דרך התאוששות של תולעי זחלים ומבוגרים לבידודה של הס. -together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig7highres.jpg" /> איור 7: אנימציה סכמטי של הס ופונקציות ההשפעות החיסונית מפתח של מתווכים מסיסים וexosomes הכילו בתוך הס. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> גנוטיפ (ומתח ברקע) </td><td> הפנוטיפ זיהום העיקרי </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> זנים טהורים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> / J, CBA, C3H </td><td> מאוד רגיש </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 וC57BL / 10 </td><td> רגיש </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / ג, DBA / 2, 129 / J </td><td> ביניים </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> רגישות נמוכה </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס לציטוקינים או קולטני ציטוקינים </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> רגיש יותר </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> רגיש פחות (א); לא חל שינוי ברגישות אך גרנולומות המוגברת (ב) </td><td> (א) 33 </td></tr><tr><td> (ב) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ הטרנסגניים (C57BL / 6) </td><td> עמיד </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> פוריות גבוהה יותר </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 או BALB / ג) </td><td> מאוד רגיש </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c או C57BL / 6) </td><td> מאוד עמיד </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 טרנסגניים(FVB) </td><td> עמיד </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Th2 הלקוי, ירד gormation granuloma </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / ג) </td><td> רגיש יותר </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / ג) </td><td> אין שינוי ברגישות </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Th1 הגבוה רגישות מוגברת, </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס עבור סמני תא T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / ג) </td><td> פוריות שולית גבוהה יותר </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / ג) </td><td> פוריות גבוהה יותר </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / ג) </td><td> ופוריות גבוהה יותר160 #; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס ללוקוסי חיסון מולדים </td><td></td></tr><tr><td> קולט מסוג 1 אינטרפרון (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> פוריות גבוהה יותר, יותר גרנולומות </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> יותר גרנולומות עמידה יותר, </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / WV (WBB6) </td><td> רגיש יותר </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: זיהומים ראשוניים עם ח &#39; polygyrus בזנים שונים עכבר וגן-targetted גנטיים.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

polygyrus Heligmosomoides הוא נמטודות עכבריות עם יכולות המערכת החיסונית חזקות שדומות לאלה של זיהום helminth אדם מאוד-שכיח. כאן אנו מתארים פרוטוקול לתחזוקה ארוך הטווח של ה &#39; מחזור החיים polygyrus.

טיפוח<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

טפיל מושרה מונע גנטית אוטואימונית מחלות לב Chagas דגם עוף

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

הערכה של מאפייני המערכת החיסוניים של תאי גזע mesenchymal האדם (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי &quot;Acufection&quot; ויישומו מחקר עור

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...