Name: cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

MERK: Alle prosedyrer i denne protokollen er utført i samsvar med retningslinjer fastsatt av Storbritannia Home Office og University of Edinburgh Veterinary Services. 1. Infeksjon av mus via sonde <ol><li> Butikk Heligmosomoides polygyrus L3 larver i destillert vann i opp til seks måneder ved 4 ° C. </li><li> Før bruk, vask L3 larver tre ganger i destillert vann: sentrifuger ved 300 xg i 10 min (med brems), fjerne alle men 500 mL av vann (for å unngå forstyrrende pelletert L3 larver) og resuspender pellet hver gang. </li><li> For det tredje vask, tilsett vann til en eksakt volum (vanligvis 40 ml) og aspirer 20 ul med en 200 mL tips kutt for å utvide sin blenderåpning. Plassere to 20 ul prøver på overflaten av en 60 mm kulturskål og telle L3-larver (vanligvis mobile, og som best kan ses i henhold til 50X forstørrelse med et disseksjonsmikroskop). Resuspender den endelige pellet i destillert vann til en-konsentrasjonn av 2000 L3 larver per ml. </li><li> For livssyklus produksjon, infisere åtte uker gamle F1 (C57BL / 6xCBA) mus med 400 H. polygyrus L3 larver i 200 mL destillert vann ved oral sondefôring (beherske mus i oppreist stilling ved nakkeskinnet og forsiktig forbi den butte gavage nål gjennom munnen og spiserøret ned i magen). Omrør grundig før hver infeksjon (larver slå seg raskt i vann) og aspireres 200 ul i en 1 ml sprøyte; bruke en dedikert gavage nål med en avrundet ende. For eksperimentell infeksjon av yngre mus (6-8 uker gamle) eller andre innavlede stammer (f.eks C57BL / 6 eller BALBc), infisere mus med 200 L3-larver. </li></ol> 2. Formering og vedlikehold av H. polygyrus <ol><li> Plasser trekull i sentrum av en stor plast badekar og la kaldt vann fra springen for å kjøre over den i minst 30 min (uvasket aktivt kull er giftig for L3 larver). Drenere vannet fra karet og kull på t plasserewo lag av absorberende papir, forlater det utsettes for romluft til det er helt tørt. </li><li> Dersom eggene er nødvendig, skrape avføring først ut av tykktarmen med pinsett og sakser (om nødvendig). Hvis et stort antall L3 larver er nødvendig, å plassere mus på en wire rutenett og samle ekskrementpelletene over flere dager. </li><li> Bland avføringen med granulert trekull i et forhold på minst 1: 1, for å oppnå en konsistens bare fuktig nok til å overholde filterpapir. Smøre et tynt lag på midten av noen fuktet filterpapir i en petriskål og sette dette i et fuktig boks (tilsett litt fuktig tørkepapir og en skål med vann) i mørket i 12-14 dager. </li><li> Fjern L3 larver fra dag 7 og utover, og samle dem på minst to anledninger før papiret er forkastet. Larvene danner en ring rundt kanten av filterpapir; løfte filterpapiret ut av petriskålen og skyll larver som er igjen av platen (ved hjelp av en pipette, og 5 ml sterilt vann pr skål) i en 50 ml-rør. </li><li> Løftav filterpapir, og høste de resterende larver igjen på platen med destillert vann i et 50 ml rør. Sentrifuger effluent-oppløsning ved 300 xg i 10 min. Vask larver tre ganger med destillert vann og deretter lagre ved 4 ° C i opp til 50 ml destillert vann inntil påkrevet. MERK: Larver forbli levedyktig og infeksiøs i minst 6 måneder. </li></ol> 3. Innsamling av Adult H. polygyrus Worms <ol><li> Klargjør det modifiserte Baermann Apparat i forkant som vist i figur 1. </li><li> Cull mus fjorten dager etter smitte. </li><li> Vask magen med 70% etanol. Skjær huden over magen og trekke tilbake for å avsløre den fremre bukvegg. Gjør midtlinjesnitt for å komme inn i bukhulen. </li><li> Fjern hele tynn- og tykktarmen (duodenum fra proksimal til den distale endetarmen). Sett inn en tørr petriskål. </li><li> Rett tarmen langs hele sin lengde; eksisere avføring som inneholder kolon; plassere dette inn i en egen rett for egg forberedelser senere. </li><li> Eksisere de proksimale 20 cm av tynntarmen som inneholder voksne ormer -identified av forholdsvis tykk vegg i tolvfingertarmen og ofte et rødt utseende på grunn av den intra-luminale ormer. Sett inn en (100 mm diameter) petriskål med 5 ml Hanks &#39;Solution, varmet til 37 ° C (to eksemplarer per parabol). </li><li> Åpne ormen fylte proksimale gut del på langs med saks (runde-ended saks er best for dette), og skrape ned innsiden av tarmen fôr med to glassplater til å fjerne ormer. Deretter kaste den rene tarmveggen. </li><li> Tips ormer i små muslin poser, stift stengt og fest med binders rundt kanten av glasstrakt (figur 1). </li><li> Fyll trakt med Hanks &#39;Solution og tilsett ca 4 petriskåler av ormer i traktene. </li><li> Sted apparat i 37 ° C inkubator i 1-2 timer, for å forsiktig agitering halvveis gjennom løsnerusk fra tarmen forberedelse som kan okkludere musselin filter. Ta vare for å unngå søl av rusk utenfor musselin bag - dette vil føre til forurensning av den endelige HMS forberedelse. Voksne ormer burde ha sakte migrert gjennom musselin klut og bosatte seg på bunnen av glasset reagensrør. Løsne prøverør fra forbindelsesgummislange over vasken nøye (ta vare å unngå å miste ormer på dette punktet). </li><li> Ved hjelp av en plast pipette, overføre ormer inn i en 50 ml tube og vask seks ganger med Hanks &#39;Solution (tillate ormer å bosette seg med tyngdekraften, fjerne medier med en stripette, tilsett 40 ml Hanks&#39; Solution og gjenta fem ganger). MERK: orm kultur må holdes sterile fra dette punktet og fremover. <ol><li> Bevege seg til en laminær strømningshette og vaske ytterligere seks ganger i steril Hanks løsning supplert med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin, klar for in vitro kultur. </li></ol></li><li> Tellevoksne ormer utvinnes ved å ta to prøver av 20 pl tatt opp med en gul spiss kutt for å utvide sin åpning; forvente ca. 50% av mengden av podet larver. </li></ol> 4. Sette opp kulturer for HMS: Medium Forberedelse, vaske Voksen Worms <ol><li> Bløt ormer fra 3,11 i ca. 10 ml RPMI supplert med 10% gentamycin i 20 minutter, slik at røret hviler i en vinkel for å sikre ormer er helt dekket. </li><li> Utføre dette i en laminær hette: Vask igjen seks ganger med Hanks &#39;Solution (supplert med 5 U / ml penicillin og 5 mikrogram / ml streptomycin). </li><li> Forberede H. polygrus media. </li><li> Å opprettholde sterilitet i en laminær strømningshette, til 500 ml av RPMI 1640, tilsett 11,1 ml av 45% glukose (sluttkonsentrasjon 1,2% som RPMI1640 inneholder 0,2% glukose), 5 ml 100 x Peniclllin-Streptomycin (sluttkonsentrasjon 5 U / ml penicillin, 5 ug / ml streptomycin), 5 ml L-glutamin (2 mM sluttkonsentrasjon), og5 ml Gentamycin (sluttkonsentrasjon 1%). Ikke legg til FCS. </li><li> Alikvote ormer inn ventilerte T25 kolber, ca. 1000 ormer i 15 ml H. polygyrus media per flaske, og sted oppreist i 37 ° C inkubator (5% CO 2) i 3 uker. </li></ol> 5. Utarbeidelse av HMS <ol><li> Samle HMS-holdige kultur media fra kulturer med intervaller på ikke lenger enn to ganger per uke, sette til side den første samlingen etter 24 timer med kultur (på grunn av høye nivåer av LPS forurensning og vertsproteiner - kan behandles separat eller kassert). Hold hver samling separat og tydelig merket med dato og batchnummer. Skift ut med et tilsvarende volum H. polygyrus media ved hver anledning. </li><li> Sentrifuger HES-inneholdende medium ved 400 x g i 5 min. Deretter filtrere sterilisere gjennom 0,2 mikrometer lav-protein-bindende filtrene inn 50 ml rør. Oppbevares i -20 ° C fryser tydelig merket med dato for orm høsting og dato for HMS-collection. </li><li> Etter 21 dager med HMS-samling fra kultur, kast ormer. </li><li> Basseng 500-1000 ml HMS supernatant (vanligvis fra frossen lager, og ikke inkludert den første 24-timers samling) og konsentrerer over en 3000 MWCO filter i ultrafiltreringsenheten nitrogentrykk. MERK: Vær veldig forsiktig med å la filteret gå tørr. <ol><li> For å sette opp filter enhet, først vaske 3 kDa membran blanke siden ned i en 1 liters kanne med destillert vann for 3 x 20 min under omrøring. Monter ultrafiltreringsenheten i henhold til produsentens instruksjoner med filter membran blanke siden opp. Plass i skap ved 4 ° C og passere 50 ml destillert vann gjennom før du begynner å konsentrere sammenslåtte HMS. </li><li> Legg til hvert rør av HES inn i filtreringsenhet som kreves (100-140 ml per dag), inntil volumet er konsentrert ned til 2-5 ml. </li></ol></li><li> For å fjerne forurensninger fra HMS-holdige kultur media, tilsett 50 ml pyrogen-free PBS til filtrering enhet og deretter konsentrere seg ned til ca 2 ml. Gjenta dette trinnet to ganger (150 ml PBS totalt). Overfør HES inn i et 15 ml rør, filtersteriliser (med et 0,2 um filter) i en laminær strømningshette og måle proteinkonsentrasjon ved hjelp av et spektrofotometer (E = 10 280) eller ved Bradford-analysen. </li><li> Delmengde, etikett med batchnummer og dato, og fryse ved -80 ° C. </li><li> Utfør en kromogen LAL analysen i henhold til produsentens protokoller på hvert parti av HMS før bruk. Hvis LPS nivåene er større enn 1 U LPS per 1 mikrogram protein, bør du vurdere å ikke bruke denne batch for in vivo eksperimenter eller in vitro kulturer. </li><li> Behandle HMS samlet på 24-timers separat på samme måte; den vil inneholde LPS og noen vertsproteiner, og samtidig ikke egnet for funksjonelle eksperimenter, er det en nyttig kilde til individuelle molekyler som kan bli isolert ved monoklonalt antistoff-affinitets-rensing. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

Livssyklusen til H. polygyrus fortsetter i en pålitelig konsekvent måte. Etter naturlig inntak eller oral føring av L3 larver på dag 0, cyster begynner å dannes under duodenal serosa etter dag 5, utvikler seg til larver moults og deretter dukker opp som voksne ormer i tarmlumen fra dag 10, kan egg sees i avføring fra dag 14 og granulomer er synlige på duodenal serosale overflate fra dag 21. Den protokoll som er beskrevet ovenfor (og sammenfattet i figur 6) gjør det mulig for high-throughput produksjon av H. polygyrus excretory-sekretorisk produkter (HMS), i tillegg til pålitelig gjenoppretting av levedyktig L3 larver for fremtidige eksperimentelle og livsløps infeksjoner. H. polygyrus infeksjon har vist seg å være beskyttende i modeller av astma avhengig OVA eller Der p 1 (Husstøvmidd allergen) 14. Videre kan undertrykkelse av luftveisinflammasjon kan overføres med CD4 + CD25 + </sup&gt; regulatoriske T-celler 14 eller CD19 + CD23 hi regulatoriske B-celler 24 fra ikke-sensitivisert, H. polygyrus -infected mus. I modeller av autoimmunitet, H. polygyrus-infeksjon har blitt vist å være undertrykkende i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) modell av multippel sklerose 9, og undertrykkelse kan overføres med enten CD4 + T-celler eller CD19 + B-celler fra infiserte mus 24. Heligmosomoides polygyrus ekskresjonssystemer-sekretoriske produkter (HES) modulerer vertens immunrespons og undertrykke Th2-mediert inflammasjon av en rekke mekanismer (som er skissert på figur 7), inkludert: a) Inhibering av dendrittisk celle respons på stimulering 25, b) induksjon av CD4 + foxp3 + regulatoriske T-celler 18. og c) blokkering av IL-33 produksjon 20. HMS er blitt vist å være beskyttende når det administreres ent sensibilisering eller utfordring i OVA-alun modell av astma 19 og også når det gis intranasalt med Alternaria ekstrakt allergen 20, gjennom undertrykkelse av tidlig IL-33 release. Unngåelse av LPS kontaminasjon av HMS er ofte avgjørende for å lykkes med fremtidige immunologiske eksperimenter. I protokollen skissert her, de kritiske trinnene i å oppnå dette er å sikre at rusk inneholdt innenfor musselin poser av den Baermann Apparatus ikke går inn i siste HMS-forberedelse (se 2.10) og å sette av ES løsning fra den første 24-timers kultur (se 5.1). Over de siste årene har HMS blitt grundig karakterisert ved proteomikk nivå med over 370 forskjellige proteiner identifisert 26,27. I tillegg har ES fra det fjerde stadium larver blitt utsatt for proteomikk analyse 28. Pågående arbeid har karakterisere de store sukkerkomponenter av HES, kjent for å være sterkt immunogent 3, og utskilt mikro RNSom det er innkapslet i 50-100 nm vesikler eller exosomes (Buck et al., Innsendt for publisering). Med etableringen av reproduserbare protokoller for innsamling av ES fra denne svært immunmodulerende parasitten, og med omfattende proteomikk data som identifiserer de molekylære komponenter av HMS, scenen er nå satt for identifikasjon og terapeutisk testing av enkeltmolekyler fra H. polygyrus som kan mediere viktige effekter på vertens immunsystem.

Heligmosomoides polygyrus er en naturlig murine gastrointestinal helminth som er nært knyttet til svært utbredte menneskelige nematode parasitter 1. I motsetning til andre nematoder modeller som Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus gående etablerer kronisk infeksjon i mus som en direkte følge av flere kraftige immunmodulerende mekanismer benytter det til å undertrykke vertens immunrespons 2. H. polygyrus har en direkte livssyklus: infeksiøs L3 larvene blir inntatt av feco-oral overføring (eller administreres av oral sonde i laboratoriet innstillingen), hvorpå de vandrer til subserosal lag av tolvfingertarmen og encyst før retur til tarmlumen som voksne ormer omtrent åtte dager etter første infeksjon. Parring og eggproduksjon skjer ved dag 10, og det er mulig å høste voksne ormer for kultur og innsamling av ekskretorisk-sekretoriske produkter fra day 14 og utover tre. H. polygyrus interagerer med det kommensal mikroflora, med økt Lactobacilli stede i infiserte mottakelige mus 4-6, og økte nivåer av H. polygyrus infeksjon etter eksponering av mus til Lactobacilli 6. Aktiv infeksjon med H. polygyrus er blitt vist å beskytte mot immunpatologi i mange dyremodeller av autoimmunitet 7-10, kolitt 11,12 og allergi 13-16. Det har derfor vært stor interesse for potensialet i Excretory-Sekretoriske molekyler fra denne parasitten (&quot;HMS&quot;) til down-modulere patologi in vivo 17,18. Faktisk er beskyttende effekt sett etter behandling av mus med HMS-produkter 19 gjennom trasé som nå blir identifisert 18,20. Her beskriver vi en protokoll for pålitelig produksjon av Heligmosomoides polygyrus og utvinning av sine utskilt produktersom kan bli ytterligere anvendt i en rekke funksjonelle biokjemiske og immunologiske undersøkelser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (tidligere kjent som Nematospiroides dubius, og også referert til av noen som H. bakeri) er en gastrointestinal helminth som sysselsetter flere immunmodulerende mekanismer for å etablere kronisk infeksjon i mus og ligner utbredte menneskelige helminth infeksjoner. H. polygyrus har blitt studert i stor utstrekning innen helminth-avledet immunregulering og har blitt funnet å potent undertrykke eksperimentelle modeller av allergi og autoimmunitet (begge med aktiv infeksjon og isolerte utskilte produkter). Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen skisserer forvaltning av H. polygyrus livssyklus for konsistent produksjon av L3 larver, gjenvinning av voksne parasitter, og innsamling av sine excretory-sekretorisk produkter (HMS).

Mottakelighet for infeksjoner med H. polygyrus styres i stor grad av den genetiske bakgrunnen av musestammen (tabell 1); C57BL / 6 og CBA-mus er svært utsatt 21,22. For opprettholdelse av parasitten livssyklus har F1 hybrid mellom disse to stammene er valgt for sin evne til å motstå mye høyere snekke belastninger uten morbiditet (dreven intestinal epithelial skade) i forhold til enten foreldrestamme. Oral føring av 400 L3-larver blir anvendt for å opprettholde sin livssyklus i F1 mus (som resulterer i voksne orm byrder som er vist i figur 2), mens en dose på 200 L3-larver er vanligvis brukt for eksperimenter i homozygot innavlede stammer (for eksempel, C57BL / 6 eller BALBc). Dette kan imidlertid dosen må reduseres avhengig av miljø co-faktorer som kan avvike mellom dyre fasiliteter, for eksempel variasjoner i tarmfloraen. Grupper av HMS har vist reproduserbar effcacy i funksjonelle analyser og i proteinsammensetningen; Dessuten, når supernatanter fra hver påfølgende uke av kulturen ble analysert, opp til totalt 4 uker ble proteinprofiler funnet å være svært lik (figur 3). Når HES-konsentrasjonen blir målt ved Bradford-analysen (se 5.5), det totale protein er vanligvis omtrent 1 mg / ml (figur 4). En alternativ metode for å konsentrere HES er med en sentrifugal-konsentrator (f.eks Vivaspin 3-kDa cut-off-membran), hvor prøvene sentrifugeres ved opp til 4000 g i en sving-ut rotor sentrifuge, fjerning av buffersalter og lavmolekylære komponenter. Sentrifugal konsentrasjon er best egnet for små bearbeidingsmengder (1-10 ml), og er begrenset til en maksimal konsentrasjonsfaktor på omtrent 30x. Ved innsamling av HMS, er å unngå forurensning kritisk. For å unngå forurensning med verts molekyler, forkaste vi HMS-continnelukker kultur media fra første 24 timer etter voksen orm høste fra musen tarmen. Vi også kvantifisere graden av LPS forurensning i hvert parti av HMS med en Chromogenic LAL analysen (se 5.7). 1 U av LPS tilsvarer ~ 100 pg LPS og nivåer under dette anses ubetydelig 23. I våre hender, de fleste grupper av HMS er betydelig under denne grensen, var gjennomsnittlig konsentrasjon av LPS i HMS være 0,23 U / mikrogram (figur 5). Effekten av LPS i in vivo-modeller av patologi (for eksempel undertrykkelse av astmatiske reaksjoner) krever minst 10 ng LPS 23. Derav in vivo administrering av 5 ug HES fra et parti med 100 pg LPS / ug HES vil inneholde 500 pg LPS, godt under den effektive konsentrasjon hvor LPS blir et problem. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figur 1: Baermann Apparatus Baermann Apparatus oppsett for innsamling av voksen H. polygyrus (som beskrevet i punkt 2). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figur 2: Gjennomsnittlig Worm Burden 14 dager etter infeksjon med 400 L3 Larver Mean orm byrder 14 dager etter smitte med 400 L3 larver. Datapunkter som vises er fra 19 separate runder med infeksjon av C57BL / 6xCBA mus. Gjennomsnitt ± SEM vist. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figur 3: Protein Profiler av HMS Fra følgende uker i Kultur SDS-PAGE profilen til HMS-proteiner som samles i påfølgende uker med kultur. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figur 4: </strong&gt; Final Antall av HMS fra 500 ml ES-holdig Media Yield av HMS protein fra 11 forskjellige grupper som stammer fra ca 500 ml kultursupernatant. Gjennomsnitt ± SEM vist. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figur 5: LPS Forurensning av HMS Nivåer av LPS forurensning i 41 grupper av HMS målt ved Limulus ameobocyte analysen. Median LPS konsentrasjon = 86 enheter per mg av HMS. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figur 6: Animerte Skjematisk av H. polygyrus Life Cycle Oppsummering av viktige livsløpsfaser fra oral føring av L3 larver, gjennom utvinning av larver og voksne ormer til isolering av HMS. Figur 7: Animerte Skjematisk av HMS og dets funksjoner Nøkkelimmunmodulerende effekter av løselige meklere og exosomes som finnes innen HMS. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype (og bakgrunnen belastning) </td><td> Primær infeksjon Fenotype </td><td> Reference </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Innavlede stammer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Svært utsatt </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 og C57BL / 10 </td><td> Mottakelige </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermediate </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Lav mottakelighet </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgen for cytokiner eller cytokinreseptorer </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Mer utsatt </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Mindre mottakelig (a); ingen endring i følsomhet, men økte granulomer (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ Transgen (C57BL / 6) </td><td> Motstandsdyktig </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Høyere fruktbarhet </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 og BALB / c) </td><td> Svært utsatt </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c eller C57BL / 6) </td><td> Meget motstandsdyktig </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 Transgenic(FVB) </td><td> Motstandsdyktig </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Mangel Th2, redusert granulomer gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Mer utsatt </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Ingen endring i følsomhet </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Høy Th1, økt mottakelighet </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgen for T cellemarkører </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Marginalt høyere fruktbarhet </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Høyere fruktbarhet </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Høyere fruktbarhet &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgen for medfødte immun loci </td><td></td></tr><tr><td> Type 1-interferon-reseptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Høyere fruktbarhet, flere granulomer </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Mer motstandsdyktig, mer granulomer </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / wv (WBB6) </td><td> Mer utsatt </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Primær infeksjoner med H. polygyrus i genetisk forskjellige og gen-målrettet musestammer.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus er et mus nematode med kraftige immunmodulerende evner som tett ligner de av svært utbredt menneskelig helminth infeksjon. Her beskriver vi en protokoll for langvarig opprettholdelse av H. polygyrus livssyklus.

Dyrking av<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; En Immunmoduler Nematode Parasite og dets utskilt produkter

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Parasite Indusert Genetisk Driven Autoimmune Chagas Hjertesykdom i Chicken Model

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening mot intracellulære<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Menneskelig Akutt monocyttisk leukemi cellelinje

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Vurdering av Immunmodulerende Properties of Human stamceller (MSC)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering av en High-throughput Oppsett for screening små molekyler som modulerer c-di-GMP signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Utvikling av en økonomisk DNA leveringssystem &quot;Acufection&quot; og dens anvendelse i Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Rapid Kvantifisering av Mitogen-indusert blastogenese i T-lymfocytter for Identifisere Immunmodulerende legemidler

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generasjon av monoklonale antistoffer mot naturlige produkter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarget flyt cytometri-baserte kvantifisering av mitokondrier og lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...