Name: quantification of the immunosuppressant tacrolimus on dried blood spots using lc-ms/ms
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS at JoVE.com

This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

De-identificerede blodprøver fra raske individer var fra University of Colorado Hospital (Aurora, Colorado). Brugen af ​​de-identificerede blod bank prøver til valideringsundersøgelser samt til udarbejdelse af kalibratorer og kvalitet kontrolprøver blev betragtet som &quot;fritaget&quot; af Colorado Multi-institutionelle Review Board (COMIRB, Aurora, Colorado). 1. Udarbejdelse af referencer og løsninger <ol><li> Indkøb tacrolimus og den interne standard D 2, 13C-t...

Selv om, som førnævnte, begrebet terapeutisk lægemiddel og overholdelse overvågning af tacrolimus baseret på tørrede blodpletter er attraktiv, er der analytiske udfordringer, som går ud over dem, der typisk er forbundet med LC-MS / MS-analyse af tacrolimus i venøst ​​EDTA hele blodprøver. Disse indbefatter, men er ikke begrænset til, det faktum, at matrixen er kapillært fuldblod gennemvædet i bomuldslinters materiale af filteret kortmateriale anvendt her og blodvolumen lav (20 pi). , High-throughput anal...

Tacrolimus er en potent immonosuppressant 1-7, der har en makrolidstruktur 8 (figur 1). På grund af cis - trans isomeri af KN obligationer det danner to rotamerer i opløsning 9, der kan adskilles ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC) Tacrolimus er lipofilt og opløselig i alkoholer (methanol: 653 g / l, ethanol: 355 g / L), halogenerede carbonhydrider (chloroform: 573 g / l) og ether. Det er tungt opløseligt i alifatiske carbonhydrider (hexan: 0,1 g / L og vand (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 Molekylet indeholder ikke nogen kromofor og dens maksimale UV-absorption er 192 nm Tacrolimus virker via hæmning af calcineurin. . Dens virkningsmekanisme er blevet revideret i referencerne 10,11. Det er i øjeblikket anvendes i mere end 80% af fast-organtransplanterede patienter i USA 12. Det terapeutiske indeks af tacrolimus er begynder at betragted til at være smalt 13. Hertil kommer, at sammenhængen mellem tacrolimus doser og koncentrationer i blodet er dårlig og farmakokinetik er variabel 14,15. Terapeutisk drug monitorering til at vejlede tacrolimus dosering hos transplanterede patienter er derfor almindelig klinisk praksis 16-20. Målet er at holde koncentrationen tacrolimus i blodet inden for en foruddefineret terapeutiske område. Tacrolimus blod koncentrationer under det terapeutiske område kan resultere i øget aktivitet af kroniske eller akutte allo-immune reaktioner, mens koncentrationer over det terapeutiske vindue øge risikoen for over-immunosuppression, kræft og toksiciteter, såsom nefrotoksicitet, neurotoksicitet, forhøjet blodtryk og diabetes. Høj farmakokinetisk intraindividuelle variation af tacrolimus kan være til skade for både transplantation orgel og patientoverlevelse 21,22. Mens inter-individuel variation af tacrolimus farmakokinetik hovedsageligt er forårsaget af CYP3A5 polymorfier, årsager til intra-individuellevariabilitet omfatter, men er ikke begrænset til, lægemiddel-lægemiddel, sygdomsfremkaldende narkotika og mad-lægemiddelinteraktioner 14,15. Også mangel på overholdelse af immunosuppressive terapeutisk lægemiddel regime er en medvirkende faktor, og en væsentlig årsag til graft tab 23,24. Disse overvejelser antyder, at hyppig hjem terapeutisk lægemiddel og overholdelse overvågning af tacrolimus hele blodkoncentrationer kan være gavnligt at sikre, at patienter har tacrolimus eksponering inden for det ønskede terapeutiske vindue på alle tidspunkter. Logistik og udgifter til hyppigere terapeutisk lægemiddelmonitorering som det er dog gældende klinisk praksis 15 er uoverkommelige. En af grundene er, at patienten har for at se en bioanalytikeren at have den krævede venøs blodprøve trukket. Tørrede blodpletter har for nylig vist sig som en attraktiv koncept 25-28. Efter en simpel finger stick patienten samler en bloddråbe på et særligt filter papir kort, og efter blod plet har dRied, kan det blive sendt til et centralt laboratorium til analyse af tacrolimus og alle andre immunundertrykkende at patienten aktuelt kan tage. Dette er blevet muligt på grund af udvikling af meget følsomme og specifikke LC-MS / MS analyser til kvantificering af tacrolimus og andre immunosuppressiva i meget små mængder blod, såsom tørrede blodpletter (typisk 20 pi blod) 25,29-43. En anden fordel er, at minimalt invasive og lave indsamlingsstrategier volumen prøve, såsom tørrede blodpletter i høj grad lette terapeutisk lægemiddel overvågning og farmakokinetiske undersøgelser hos små børn 28. Tacrolimus måles normalt i venøst ​​EDTA fuldblod 15. Årsager er, at tacrolimus i udstrakt grad fordeles i blodlegemer, og at kliniske undersøgelser har rapporteret bedre sammenhæng mellem tacrolimus trough-koncentrationer i blodet end i plasma med kliniske hændelser 15,18. Til sammenligning analysen af ​​tacrolimus i tørrede blodpletter er baseret på kapillærblod der er blandet med filtrerpapiret matrix. Dette giver udfordringer i forhold til opløsning af tacrolimus og potentielle interferenser med LC-MS / MS-analyse. Vi præsenterer her en etableret og valideret assay baseret på homogenisering af tørret blod stedet ved hjælp en kugle blender i kombination med et højt flow online kolonne prøve rense procedure og LC-MS / MS-analyse. Som i dag, har denne analyse med succes været anvendt til kvantificering af mere end fem tusinde tacrolimus tørret blod stikprøver for at overholde overvågning i kliniske forsøg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reference Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacrolimus</td>
			<td>U.S. Pharmacopeial Convention</td>
			<td>1642802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2,13C-Tacrolimus</td>
			<td>Toronto Research Chemicals Inc.</td>
			<td>F370002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W20091305500 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W2017130556300Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone CHROMASOLV, HPLC, &#8805; 99,9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439126-4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 99.9 %, HPLC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2632-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/ MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A118P-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Instruments and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 &#8211; 10 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#8211; 100 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 10XLS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#8211; 1000 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2940</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#8211; 20 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#8211; 200 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1237-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2938T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2936J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL- Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L inserts for&#160; HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO-9973-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance PR2002</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1117050723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balances AX205 Delta Range</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1119343379</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Biofuge Fresco</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>290395</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Wipes</td>
			<td>PDI</td>
			<td>Q55172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass v ials, 4 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials, 20 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B7800-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves, nitrile</td>
			<td>Titan Brand Gloves</td>
			<td>44-100S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 9921-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lids for HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 8952-13-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 18G 1.5</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-541-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel beads 0.9 &#8211; 2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage boxes for freezers / refrigerators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-395-464</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard multi-tube vortexer</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>658816-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td>
			<td>GE Whatman&#160;</td>
			<td>2016-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Equipment and Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>CTC PAL&#160;</td>
			<td>PAL.HTCABIx1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1260 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G1312B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1290 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G4220A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vacuum degasser, Agilent 1260</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G13798</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column oven,&#160; Agilent 1290 with 2 position&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1216C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1316C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 12.5 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>820950-926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 150 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>993967-906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API5000 MS/MS with TurboIonspray source</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>4364257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Analyst 1.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the immunosuppressant tacrolimus on dried blood spots using lc-ms/ms

Den calcineurinhæmmer tacrolimus er hjørnestenen i de fleste immunosuppressive behandling protokoller efter organtransplantation i USA. Tacrolimus er et snævert terapeutisk indeks narkotika, og som sådan kræver terapeutisk drug monitorering og dosisjustering baseret på hele dens blod dalkoncentrationer. For at lette hjem terapeutisk lægemiddel og overholdelse overvågning, indsamling af tørrede blodpletter er en attraktiv koncept. Efter en finger stick, patienten samler en bloddråbe på filterpapir derhjemme. Efter blodet tørres, er det sendt til analyselaboratoriet hvor tacrolimus kvantificeres ved hjælp af høj-performance væskekromatografi-tandem-massespektrometri (HPLC-MS / MS) i kombination med en enkel manuel protein udfældningstrin og online kolonne ekstraktion. For tacrolimus analyse, er en 6-mm plade udstanset fra mættet centrum af blodet stedet. Blodet stedet homogeniseres ved hjælp af en blender bullet and derefter proteiner udfældes med methanol / 0,2 M ZnSO4 indeholdende den interne standard D 2, 13 C-tacrolimus. Efter hvirvelblanding og centrifugering 100 pi supernatant injiceres i et online ekstraktion søjle og vasket med 5 ml / min på 0,1 myresyre / acetonitril (7: 3, vol: vol) i 1 min. I det følgende er skifteventilen aktiveret og analysander back-skyllet på den analytiske søjle (og separeret under anvendelse af en 0,1% myresyre / acetonitrilgradient). Tacrolimus er kvantificeret i den positive multi reaktionsmåden (MRM) med en tandem-massespektrometer. Assayet er lineært fra 1 til 50 ng / ml. Inter-assay variation (3,6% -6,1%) og nøjagtighed (91,7% -101,6%) som vurderes over 20 dage mødes godkendelseskriterier. Gennemsnitlig udvinding opsving er 95,5%. Der er ingen relevant overførsel, matrix interferens og matrix effekter. Tacrolimus er stabil i tørrede blodpletter ved stuetemperatur og ved +4 ° C i 1 uge. Ekstraherede prøver iautosampler er stabile ved 4 ° C i mindst 72 timer.

Repræsentative ionchromatogrammer af en blindprøve, en prøve tilsat ved den nedre grænse for kvantificering og en patientprøve er vist i figur 3. Kalibreringskurver Den nedre detektionsgrænse var 0,5 ng / ml og den nedre grænse for kvantificering var 1,0 ng / ml. Halvtreds ng / ml blev valgt som den højeste kalibrator som er usandsynligt, at blive nået i klinikken under normale omstændigheder højere koncentrationer. <p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS at JoVE.com

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Kvantificering af det immunsuppressive Tacrolimus om Tørrede blodpletter ved LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

En Contusive Model af Unilateral Cervikal Rygmarvsskader Brug af Uendelige Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Dannelse af humane prostata Epitel Brug Tissue rekombination af Rodent Urogenital Sinus mesenkymet og menneskelige stamceller

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Tørret blod Spot Collection of Health Biomarkører at maksimere Deltagelse i befolkningsundersøgelser

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Absolute Quantification of AÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Absolut Kvantificering af Ap<sub&gt; 1-42</sub&gt; I CSF Brug massespektrometrisk reference Measurement Procedure

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimeret LC-MS/MS metoden til høj overførselshastighed analyse af kliniske prøver af Ivacaftor, dets vigtigste metabolitter, og Lumacaftor i biologiske væsker af cystisk fibrose patienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

En kronisk hjerte iskæmi Model i svin ved hjælp af en Ameroid kvælerslange

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Forbedret metode til etablering af et In Vitro blod - hjerne barrieren Model baseret på svin hjernen Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

Blod opsamling gennem subclavian venepunktur i mus

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluering af cerebral Blood flow Autoregulation i rotter ved hjælp af Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Valideret LC-MS/MS Panel til kvantificering af 11 resistente TB-medicin i små hårprøver

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...