Name: quantification of the immunosuppressant tacrolimus on dried blood spots using lc-ms/ms
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS at JoVE.com

This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

건강한 사람에서 드 확인 된 혈액 샘플은 콜로라도 병원의 대학 (오로라, 콜로라도)에서 있었다. 유효성 연구뿐만 아니라, 구경 및 품질 대조 시료의 제조 디 식별 혈액 은행 샘플의 사용은 콜로라도 멀티위원회 (Institutional Review Board COMIRB, 오로라, 콜로라도)에서 &quot;제외&quot;으로 간주 하였다. 참고 문헌 및 솔루션 1. 준비 <ol><li> 구매 타 크롤리 무스와 내부 표준 D 2,</sub...

전술 한 바와 같이, 건조 혈액 반점에 기초 치료약 및 타 크롤리 무스의 부착 모니터링 개념 매력적이며, 비록 전형적 정맥 EDTA 전혈 샘플에 타크로리무스의 LC-MS / MS 분석과 연관된 넘어 분석 과제가있다. 이들은 다음을 포함하지만, 여기에 사용되는 행렬은 필터 카드 재료와 저 혈량 (20 μL)의 코튼 린터 재료에 담가 모세관 전혈 사실, 이에 한정되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 중앙 연구소에서 ?...

타 크롤리 무스는 마크로 라이드 구조 (8) (그림 1)이 강력한 immonosuppressant 1-7이다. 653g / L, 에탄올 : - 시스로 인한 CN 결합의 트랜스 이성질체는 역상 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리 될 수있는 용액을 9 개의 로타 머를 형성한다 (HPLC)은 타 크롤리 무스는 알코올 (메탄올 중의 지용성 및 수용성 355 G / L), 할로겐화 탄화수소 (클로로포름 : 573g / L) 및 에테르. . 0.1 G / L 및 물 (pH를 3 : 그것은 지방족 탄화수소 (헥산에 난 용성이다. 분자가 어떤 발색단과 자외선 최대 흡수를 포함하지 않는 9 0.0047 g / L) 칼시 뉴린 억제를 통해 192 nm의 타 크롤리 무스의 역할입니다 . 그 작용 메커니즘은 참조 10,11에서 검토되었다. 현재는 미국 (12)에 고체 기관 이식 환자의 80 % 이상으로 사용된다. 타크로리무스의 치료 지수는 considere있는 것이다D 13 좁은합니다. 또한, 타 크롤리 무스 및 투여 혈중 농도 간의 상관 관계는 좋지는 14,15 및 약동학 변수이다. 이식 환자에서 타 크롤리 무스 투여를 안내하는 치료 약물 모니터링 따라서 일반적으로 임상 실습 16 ~ 20입니다. 목표는 미리 정의 된 치료 범위 내에 타크로리무스의 혈중 농도를 유지하는 것이다. 치료 창 이상의 농도가 과다 면역, 암 등의 신 독성, 신경 독성, 고혈압, 당뇨병 등의 독성에 대한 위험이 증가하는 동안 치료 적 범위보다 타크로리무스 혈중 농도는 만성 또는 급성 동종 면역 반응의 활성이 증가 될 수 있습니다. 타 크롤리 무스의 높은 약동학 내 개인 변동성 이식 기관과 환자 생존율 (21, 22) 모두에 해가 될 수있다. 타 크롤리 무스의 약동학의 간 개별 변동은 주로 CYP3A5 다형성, 내 개인에 대한 이유에 의해 발생되는 동안변동성이 포함되지만, 약물 - 약물, 질병 - 약물 및 식품 - 약물 상호 작용 14, 15에 한정되는 것은 아니다. 또한 면역 억제 치료 약물 처방을 준수의 부족은 요인 및 이식 손실 (23, 24)에 대한 주요 이유입니다. 이러한 고려 사항은 빈번한 홈 치료약 및 타크로리무스 전혈 농도 부착 모니터링 환자가 항상 원하는 치료 창 내 타크로리무스 노출을 가질 수 있도록하는 것이 유익 할 수 있음을 시사한다. 그러나, 현재의 임상 15 금지 인 물류 및 더 빈번한 모니터링 치료약의 비용 때문이다. 그 이유 중 하나는 환자 phlebotomist 그린 필요한 정맥 혈액 샘플을 가지고 참조한다는 것이다. 말린 혈액 반점은 최근에 매력적인 개념 25-28로 등장했다. 환자 스틱 간단한 손가락 한 것은 특수 필터 종이 카드 및 혈액 자리가 거라고 한 후 혈액 방울을 수집리 에드, 그것은 타 크롤리 무스의 분석과 환자가 현재 복용 될 수 있음을 다른 면역 억제제를위한 중앙 실험실로 발송 될 수있다. 이는 건조 혈액 명소 (혈액의 일반적으로 20 μL) 25,29-43로 인해 아주 작은 혈액 볼륨에서 타 크롤리 무스와 다른 면역 억제제의 정량에 매우 민감하고 특정 LC-MS는 / MS 분석의 개발이 가능하게되었다. 또 다른 장점은 건조 혈액 명소로 최소 침습, 낮은 볼륨 시료 채취 전략은 크게 어린이 (28)의 치료 적 약물 모니터링 및 약동학 적 연구를 촉진한다는 것이다. 타 크롤리 무스는 일반적으로 정맥 EDTA 전혈 (15)로 측정됩니다. 이유는 타 크롤리 무스가 광범위하게 혈액 세포로 배포하는 것이 임상 연구는 임상 이벤트 15,18 플라즈마에 비해 혈중 타 크롤리 무스 통 농도 사이 좋은 상관 관계를보고했다고한다. 비교하여, TA의 분석건조 혈액 반점에서 crolimus은 여과지 매트릭스와 혼합 모세관 혈액에 기초한다. 이것은 LC-MS / MS 분석으로 타크로리무스 및 잠재적 간섭의 가용화면에서 과제를 제시한다. 여기에서 우리는 높은 흐름 온라인 열 샘플 정리 절차 및 LC-MS / MS 분석과 함께 총알 블렌더를 사용하여 건조 혈액 자리의 균질화를 기반으로 설립 검증 분석을 제시한다. 오늘날,이 분석은 임상 시험을 성공적으로 부착 모니터링 이상의 오천 타크로리무스 건조 혈액 샘플의 스폿 정량화에 사용되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reference Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacrolimus</td>
			<td>U.S. Pharmacopeial Convention</td>
			<td>1642802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2,13C-Tacrolimus</td>
			<td>Toronto Research Chemicals Inc.</td>
			<td>F370002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W20091305500 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W2017130556300Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone CHROMASOLV, HPLC, &#8805; 99,9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439126-4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 99.9 %, HPLC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2632-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/ MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A118P-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Instruments and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 &#8211; 10 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#8211; 100 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 10XLS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#8211; 1000 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2940</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#8211; 20 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#8211; 200 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1237-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2938T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2936J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL- Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L inserts for&#160; HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO-9973-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance PR2002</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1117050723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balances AX205 Delta Range</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1119343379</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Biofuge Fresco</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>290395</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Wipes</td>
			<td>PDI</td>
			<td>Q55172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass v ials, 4 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials, 20 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B7800-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves, nitrile</td>
			<td>Titan Brand Gloves</td>
			<td>44-100S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 9921-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lids for HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 8952-13-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 18G 1.5</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-541-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel beads 0.9 &#8211; 2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage boxes for freezers / refrigerators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-395-464</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard multi-tube vortexer</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>658816-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td>
			<td>GE Whatman&#160;</td>
			<td>2016-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Equipment and Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>CTC PAL&#160;</td>
			<td>PAL.HTCABIx1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1260 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G1312B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1290 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G4220A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vacuum degasser, Agilent 1260</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G13798</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column oven,&#160; Agilent 1290 with 2 position&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1216C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1316C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 12.5 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>820950-926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 150 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>993967-906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API5000 MS/MS with TurboIonspray source</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>4364257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Analyst 1.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the immunosuppressant tacrolimus on dried blood spots using lc-ms/ms

칼시 뉴린 억제제 타 크롤리 무스는 미국에서 고체 장기 이식 후 대부분의 면역 치료 프로토콜의 초석이다. 타 크롤리 무스는 좁은 치료 지수 약물이며, 등은 치료 적 약물 모니터링 및 전체 혈액 통 농도를 기반으로 용량 조절이 필요합니다. 가정 치료 약물 및 준수 모니터링을 용이하게하기 위해, 건조 혈액 명소의 컬렉션은 매력적인 개념이다. 핑거 스틱 후, 환자는 집에서 필터 종이에 혈액 방울을 수집한다. 혈액이 건조 된 후에는 타크로리무스는 고성능 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법을 이용하여 정량화 분석 실험실로 송부 (HPLC-MS / MS) 간단한 수동 단백질 침전 단계 및 온라인 열 추출과 조합. 타 크롤리 무스 분석을 위해, 6 mm 디스크는 혈액 스폿의 중심으로부터 펀칭 포화된다. 혈액 자리는 총알 블렌더를 사용하여 균질화ND 후 단백질은 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4 내부 표준 D 2, C-13을 함유 타크로리무스로 침전된다. 볼 텍싱 및 원심 분리 후, 상청액 100 μL를가 온라인 추출 칼럼에 주입하고, 5 ㎖ / 0.1 포름산 / 아세토 니트릴로 세정 분 (7 : 3, V : V) 1 분. 이하, 전환 밸브가 작동하고 분석 물은 분석 컬럼에 백 플러시 (및 0.1 % 포름산 / 아세토 니트릴 구배를 사용하여 분리)된다. 타크로리무스는 탠덤 질량 분석 장치를 사용하여 다중 반응 양성 모드 (MRM)으로 정량화된다. 분석은 50 ng 내지 1 / ㎖에서 선형이다. 로 이십일에 걸쳐 평가 간 분석 변동 (3.6 % -6.1 %)과 정확성 (91.7 % -101.6 %)이 허용 기준을 충족. 평균 추출 회수는 95.5 %이다. 이월, 매트릭스 간섭 및 매트릭스 효과 아무런 관련이 없습니다. 타 크롤리 무스는 실온에서 1 주일 동안 4 ℃에서 건조 혈액 명소에서 안정적이다. 에서 추출 된 샘플오토 샘플러는 최소 72 시간 동안 4 ℃에서 안정하다.

블랭크 샘플의 대표적인 이온 크로마토 그램은, 샘플은도 3에 도시되어 정량화 및 환자 샘플의 하한에서 아군. 교정 곡선 검출 하한은 0.5 ml의 NG /이었고, 정량 하한은 1.0 ng를 / ㎖이었다. 높은 농도가 정상적인 상황에서 병원에 도달 할 가능성이 있습니다로 쉰 NG는 / ml로 가장 높은 교정기로 선정되었다. 교정 곡선은 갓...

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Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

연구

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