Name: generation of murine cardiac pacemaker cell aggregates based on es-cell-programming in combination with myh6-promoter-selection
Uploaded: 2015-02-17T15:00:00
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1. Recomendações Antes da partida <ol><li> Não use PSCs contaminadas por micoplasmas, porque não vai diferenciar adequadamente nas células do nó sinusal. Teste para contaminação por micoplasma, antes de iniciar o protocolo. Faça isso usando um kit de PCR para detecção rápida, altamente sensível de micoplasmas e seguir o protocolo do fabricante. </li><li> Para cada placa de Petri (passo 2.3.4), um casaco 10 2 célula cultura prato com estéril gelatina 7 ml de 0,1% a partir de pele de peixe de ?...

<ol>
	<li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2++channel+blockers.">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).</li><li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MesP1+drives+vertebrate+cardiovascular+differentiation+through+Dkk-1-mediated+blockade+of+Wnt-signalling.">MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling.</a> Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).</li><li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+programming+of+pluripotent+stem+cells+towards+distinct+cardiovascular+cell+types.">Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types.</a> Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).</li><li>Hoogaars, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx3+controls+the+sinoatrial+node+gene+program+and+imposes+pacemaker+function+on+the+atria.">Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria.</a> Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).</li><li>Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+selected+cardiomyocytes+from+differentiating+embronic+stem+cells+form+stable+intracardiac+grafts.">Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts.</a> J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).</li><li>Marger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+activity+and+ionic+currents+in+mouse+atrioventricular+node+cells.">Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells.</a> Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).</li><li>Jung, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+and+isolation+of+highly+pure+physiologically+and+pharmacologically+functional+sinus-nodal+bodies+from+pluripotent+stem+cells).">Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells).</a> Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).</li><li>Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+differentiated+in+vitro+from+embryonic+stem+cells+developmentally+express+cardiac-specific+genes+and+ionic+currents.">Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents.</a> Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).</li><li>He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+develop+into+multiple+types+of+cardiac+myocytes:+action+potential+characterization.">Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization.</a> Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).</li><li>Yanagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+and+T-type+calcium+channels+confer+automaticity+of+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).</li><li>Barbuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+composition+and+functional+properties+of+f-channels+in+murine+embryonic+stem+cell-derived+pacemaker+cells.">Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li><li>David, R., Franz, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pluripotency+to+distinct+cardiomyocyte+subtypes.">From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes.</a> Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).</li><li>Scavone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+CD166++precursors+develop+into+fully+functional+sinoatrial-like+cells).">Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells).</a> Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).</li><li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation+and+characterization+of+HCN4-positive+pacemaking+cells+derived+from+murine+embryonic+stem+cells+during+cardiac+differentiation.">Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation.</a> Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).</li><li>Wiese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+sinus+node+head+and+differentiation+of+sinus+node+myocardium+are+independently+regulated+by+Tbx18+and+Tbx3.">Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3.</a> Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).</li><li>Kleger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+calcium-activated+potassium+channels+induces+cardiogenesis+of+pluripotent+stem+cells+and+enrichment+of+pacemaker-like+cells.">Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells.</a> Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).</li><li>Bakker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-box+transcription+factor+TBX3+reprogrammes+mature+cardiac+myocytes+into+pacemaker-like+cells.">T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells.</a> Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).</li><li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18.">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).</li><li>Johns, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+expression+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+vitro+(rat+cardiac+myocytes)+and+in+vivo+(rat+liver).+A+novel+strategy+for+modifying+excitability.">Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability.</a> J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).</li><li>Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+human+potassium+channel+suppresses+cardiac+hyperexcitability+in+rabbit+ventricular+myocytes.">Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes.</a> J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).</li></ol>

A capacidade para produzir células estaminais derivadas de marcapasso cardíaco pode permitir a reconstituição de células do ritmo cardíaco adequado no sentido de &quot;pacemakers&quot; biológicos. Da mesma forma, o teste de drogas in vitro se beneficiará de sua disponibilidade. PSCs pode dar origem a qualquer tipo de célula do corpo dos mamíferos, incluindo os cardiomiócitos com propriedades de células marcapasso 8,9,10,11,12,13. No entanto, normalmente as populações de células dentro de &quot;...

O termo &quot;síndrome do nódulo sinusal&quot;, resume várias doenças que levam à deterioração do sistema de marcapasso cardíaco. Compreende patológico, bradicardia sintomática sinusal, bloqueio sinoatrial, parada sinusal, bem como a síndrome de taquicardia-bradicardia. Desse modo, a &quot;síndrome do nódulo sinusal&quot; é muitas vezes acompanhada por doenças cardíacas em geral, tais como doença cardíaca isquêmica, cardiomiopatias ou miocardite. Actualmente, as abordagens terapêuticas são baseadas na implantação de pacemakers eléctricos. No entanto, este vai, juntamente com um certo número de riscos, tais como infecções e falha da bateria. No geral, a incidência de complicações é ainda muito elevada em pacientes tendo implantado um marcapasso artificial. Além disso, ao contrário do pacemaker endógena, esses dispositivos não respondem à estimulação hormonal. Uma alternativa futuro poderá contar com a disponibilidade de &quot;pacemakers biológicas&quot; para o qual poderia servir PSCscomo uma fonte celular adequada e que também seria muito valioso para o teste da droga em vitro. No entanto, um grande problema reside na aparência muito raro de células nodais sinusite dentro de corpos embrióides (EBS) - isso normalmente não ultrapassa 0,5% ~ 1. Anteriormente, foi demonstrado que a &quot;programação para a frente&quot; no sentido de subtipos específicos de cardiomiócitos é viável através de sobre-expressão de fatores cardiovasculares precoces distintas de transcrição como o fator 1 (MesP1) específico-posterior-Mesoderma e NK2 transcrição relacionado, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Para o tamanho e função do nó sinoatrial (SAN) normal, o T-box factor de transcrição Tbx3 é crucial, o qual tem sido mostrado para iniciar o programa de gene pacemaker e para controlar a diferenciação do SAN 4. Embora este reforço a aparência de células pacemaker funcional, o conteúdo ainda não exceda ~ 40% da população de células cardiomyocytic inteiro. Portanto, uma etapa de seleção antibiótico baseado Myh6-promotor adicional de 5 foi introduzido por nós. Isto conduz, finalmente, para os agregados de cardiomiócitos ainda não observados (&quot;corpos induzidos sino-atrial;&quot; iSABs &quot;) que exibem um aumento altamente frequências batendo (&gt; 400 bpm) in vitro, para a primeira vez que se aproximam dos de um coração de murídeo e comparável ao cultivo in vitro células nodais sinusite isoladas de um coração murino 6. Sob a administração Isoprenalina batendo mesmo freqüências de 550 bpm são alcançados. Notavelmente, iSABs consistem em mais de 80% de células nodais funcionais, como é evidente a partir de extensa fisiológica analisa 7. Recentemente, várias abordagens para gerar células nodais seio usando reprogramação direta 19, marcadores de superfície 14 ou tratamento farmacológico com pequenas moléculas 16,17 foram descritos. No entanto, nenhum destes métodos conduziram a um tal elevado grau de pureza das células ea batendo frequências próximas da murino elearte como observado em iSABs. Além disso, em um modelo ex vivo de fatias ventriculares adulto rato cultivadas que perderam a sua actividade batimento espontâneo, os iSABs são capazes de integrar no tecido fatia, mantendo-se, assim, espontaneamente ativa e enérgica estimulação as fatias de coração para contrações 7. Um protocolo detalhado para a geração destas iSABs é descrito neste documento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:131px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s liquid medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>FG 0465</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>FG 0435</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLS type IV, CLS IV</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>C4-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Non-essential amino acids</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>K 0293</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS Superior</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0615</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L 0473</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A 2912</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile</td>
			<td>Brand</td>
			<td>703409</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accutase</td>
			<td>eBioscience,Inc.</td>
			<td>00-4555-56</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P11-010</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri Dishes</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>663102</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS without Ca and Mg</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leukemia inhibitory factor</td>
			<td>Phoenix Europe GmbH</td>
			<td>LIF-250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quadratic petri dishes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PX67.1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>G7765</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>M3148&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Thioglycerol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>M6145</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture test plates (24 well)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of murine cardiac pacemaker cell aggregates based on es-cell-programming in combination with myh6-promoter-selection

O tratamento da &quot;síndrome do seio doente&quot; é baseado no marcapasso artificial. Estes suportar riscos, tais como falha da bateria e infecções. Além disso, eles não têm a capacidade de resposta da hormona e do procedimento geral é de custo elevado. &quot;Pacemakers biológicos&quot; gerados a partir de unidades de atendimento pode ser uma alternativa, no entanto, o conteúdo típico de células marcapasso em corpos embrióides (EBS) é extremamente baixo. O protocolo descrito combina &quot;programação para a frente&quot; de PSCs murino via o indutor TBX3 nó sinusal com a seleção antibiótico baseado Myh6-promotor. Isso produz agregados cardiomiócitos consistentes de&gt; 80% de células marcapasso fisiologicamente funcionais. Estes &quot;induzida por sinoatrial-corpos&quot; (&quot;iSABs&quot;) estão se contraindo de forma espontânea em frequências ainda não alcançados (400-500 bpm) correspondentes às células nodais isoladas de corações do rato e são capazes de andar miocárdio murino ex vivo. Utilizando o protocolo descrito seio altamente puracélulas individuais nodais pode ser gerada, o que por exemplo pode ser usado para o teste de drogas em vitro. Além disso, os iSABs gerados de acordo com este protocolo pode tornar-se um passo crucial para a engenharia de tecidos do coração.

O protocolo descrito permite a geração de iSABs com uma freqüência de batimento de cerca de 450 bpm de unidades de atendimento (mostrados no filme), que fica perto da freqüência de batimento do coração mouse. Após dissociação de iSABs (passo 2.8.8) as células individuais observados mostram a forma típica de células do nódulo sinusal (células fusiformes e da aranha), como mostrado na Figura 1. Estas células proteínas altamente expresso, que são conhecidos como sendo essencial para a fu...

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Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Este protocolo descreve como produzir tecido nodal sinusal funcional a partir de células-tronco pluripotentes murino (PSC). T-Box3 (TBX3) superexpressão mais cardíaco miosina de cadeia pesada (Myh6) seleção antibiótico promotor conduz a agregados de células marcapasso altamente puras. Estes &quot;induzida por sinoatrial-corpos&quot; (&quot;iSABs&quot;) contêm mais de 80 células marcapasso%, mostram altamente aumento das taxas de espancamento e são capazes de andar miocárdio ex vivo.

Geração de Murino Marcapasso Cardíaco Agregados célula com base na ES-Cell-Programação em combinação com Myh6-Promotor-Seleção

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Geração de Agregados of Mouse Células-Tronco Embrionárias que mostram quebra de simetria, Polarização e Comportamento Coletivo Emergent<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

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Agregada Optimization Tamanho em micropoços para sistemas baseados em Suspensão Cardiac diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas

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