Name: use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms
Uploaded: 2014-12-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms at JoVE.com

Forfatterne takker William Nance (University of Michigan) om hjælp til at formulere de protokoller biofilm vækst og John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) for rådgivning om teknologiske spørgsmål i forbindelse med Bioflux systemet. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 til AHR) og University of Michigan startfonde til AHR

Den spyt indsamlingen protokollen beskrevet heri blev gennemgået af University of Michigan Institutional Review Board for menneske Research. BEMÆRK: Med hensyn til de institutionelle anmeldelser for menneske arbejde af denne type, bør forudgående ordninger og tilladelser vundet fra værtsinstitutionen. Især afhængig af institutionen, kan IRB eller etik godkendelse skal søges og godkendes, før spyt samling fra frivillige kan fortsætte. Som en hjælp til at udarbejde en ansøgning, kan en nyttig NIH algori...

<ol>
	<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).</li><li>Wimpenny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metropolis.">Microbial metropolis.</a> Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).</li><li>Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+ruin:+the+formation+of+disease-associated+oral+biofilms.">The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms.</a> Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Cate, J. M., Zaura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+numerous+microbial+species+in+oral+biofilms:+how+could+antibacterial+therapy+be+effective.">The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective.</a> Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).</li><li>Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+collective+recalcitrance+of+microbial+biofilm+communities.">The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities.</a> Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , (2011).</li><li>Smith, H., Smith, H., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. , 1-29 (1964).</li><li>Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+microbial+aspects+of+periodontal+biofilm+communities,+development+and+treatment.">Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment.</a> Periodontology. 42, 7-12 (2000).</li><li>McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+In+vitro+biofilm+models:+an+overview.">Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview.</a> Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).</li><li>Baehni, P. C., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-plaque+agents+in+the+prevention+of+biofilm-associated+oral+diseases.">Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases.</a> Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).</li><li>Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+oral+microbial+communities+of+wild-type+and+toll-like+receptor+2-deficient+mice+using+a+454+GS+FLX+Titanium+pyrosequencer.">The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer.</a> BMC microbiology. 10, 101 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel.">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).</li><li>Auschill, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+two+antimicrobial+agents+on+early+in+situ+biofilm+formation.">Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation.</a> Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).</li><li>Coenye, T., Nelis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+model+systems+to+study+microbial+biofilm+formation.">In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.</a> Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+biofilms+in+antimicrobial+resistance.">Role of biofilms in antimicrobial resistance.</a> ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).</li><li>Wimpenny, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+validity+of+models.">The validity of models.</a> Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).</li><li>Umland, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-validated+essential+genes+identified+in+Acinetobacter+baumannii+by+using+human+ascites+overlap+poorly+with+essential+genes+detected+on+laboratory+media.">In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media.</a> 3 (4), (2012).</li><li>Nance, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+dental+plaque+biofilm+system+to+visualize+and+quantify+the+effect+of+antimicrobials.">A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).</li><li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li><li>Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+approaches+for+multidimensional+biological+image+data.">Visualization approaches for multidimensional biological image data.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+an+alcohol-free+CPC-containing+mouthwash+against+oral+multispecies+biofilms.">Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms.</a> The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology.">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).</li><li>Kim, J., Park, H. D., Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+to+bacterial+biofilm+formation.">Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation.</a> Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).</li><li>Mosier, A. P., Cady, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+bacterial+surface+interactions+using+microfluidic+systems.">Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems.</a> Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).</li><li>Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multispecies+oral+bacterial+community+in+a+saliva-conditioned+flow+cell.">Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).</li><li>Cuadra-Saenz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer-2+influences+interactions+amongst+pioneer+colonizing+streptococci+in+oral+biofilms.">Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms.</a> Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).</li><li>Rickard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer+2:+a+concentration-dependent+signal+for+mutualistic+bacterial+biofilm+growth).">Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth).</a> Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).</li><li>Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+penetration+and+efficacy+in+an+in+vitro+oral+biofilm+model.">Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).</li><li>Diggle, M. A., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+sequence+typing+at+the+speed+of+light.">Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light.</a> Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).</li><li>Hiyari, S., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+diagnostics:+molecular+analysis+of+oral+biofilms.">Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms.</a> Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).</li><li>Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+biofilms:+emerging+concepts+in+microbial+ecology.">Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology.</a> Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+in+the+age+of+genomics+and+metagenomics:+concepts,+tools,+and+recent+advances.">Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances.</a> Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).</li><li>Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches.">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li><li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms.">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li><li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews).">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li><li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling.">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li><li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing.">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li><li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas.">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li></ol>

Denne metoder fremhæves de grundlæggende trin, der kræves for at opsætte og køre et mikrofluidsystem på en sådan måde at give mulighed for udvikling af orale flere arter biofilm afledt fra puljet human spyt og dyrket i filtersteriliseret 25% poolet humant spyt. Approaches at karakterisere biofilm er givet, men det bør erindres, at disse beskrevne fremgangsmåder er modificerbare og yderligere teknologier, såsom for eksempel kan indføres pletter eller etiketter. Som et spørgsmål eksempel kunne man forestille...

<html> Biofilm er arkitektonisk komplekse samfund af bakterier, som sammendrages på overflader 1. Disse samfund indeholder typisk mange arter, der interagerer med hinanden i biofilmen 2. Mundtlige biofilm, de mest visuelt iøjnefaldende er plak, er et vedvarende problem i mennesker og deres ukontrollerede udviklingsresultater i frembringelsen af taksonomisk forskellige multi-arter samfund 3. Komponenten bakterier af disse forskelligartede samfund kan være op til 1.000 gange mere modstandsdygtige over for antibiotika end deres frit svævende (planktoniske) modstykker 4-6. Manglende behandling af disse orale biofilm samfund, som kan forårsage caries og paradentose, har resulteret i en betydelig offentlig sundhed byrde: over 500 millioner besøg hos tandlægen kontor om året i USA, og en ca. 108 milliarder dollar til at behandle eller forebygge periodontal sygdom og caries 7. indhold &quot;&gt;&quot; Mens mange mikrobiologer fortaler studerer mikrobiel opførsel under naturlige forhold, nogle af dem gør det. Det skyldes, at deres moral for at overvinde de vanskeligheder, konstant undergravet af den attraktive nem at arbejde med laboratorie kulturer. &quot;-Smith 8. På nuværende tidspunkt er oral biofilm forskning hjælp af en række in vivo og in vitro metoder, hver med deres egne fordele og ulemper 9,10. In vitro metoder bruger ofte model biofilm systemer, der er forholdsvis nem at sætte op, men kan mangle klinisk / virkelige verden relevans 10,11. In vivo metoder typisk afhængige dyremodelsystemer der kan reproducere visse aspekter af den menneskelige orale miljø, men igen lider begrænsninger på grund af forskelle i anatomi, fysiologi, mikrobiologi og immunologi mellem dyr og mennesker 12, 13.. Det skal bemærkes, at oral biofilmkan også udvikles på emaljeoverflader afholdt i en stent i munden på frivillige forsøgspersoner, men denne fremgangsmåde er i øjeblikket relativt dyrt og arbejdskrævende 14,15. I sidste ende, er nye midler eller teknologier til forbedring tandpleje testet på mennesker under kontrollerede forsøg vilkår 11 kliniske. På nuværende tidspunkt er en ofte brugt modus operandi for at identificere og evaluere nye tandpleje midler er først at udføre laboratorieundersøgelser for at skelne den potentielle effekt, og derefter udføre dyreforsøg og &quot;markforsøg&quot;, der beskæftiger klinikere at vurdere succes teknologi 9, 16,17. Desværre laboratorieundersøgelser har tendens til at stole på modelsystemer, der optager en stor fodaftryk, er teknologisk udfordrende at bruge, og indeholder ofte forenklede samfund af ét eller højst nogle få arter at udlede potentielle virkelige verden betyder 10,18. Eftersom tandplak biofilm indeholde flere arter og form rundex strømmende spyt miljø, udvikling biofilm, der indeholder en eller nogle få arter i kunstig medier er usandsynligt at generere samfund, der opfører sig på en måde svarende til dem i den virkelige verden scenario 10,19. For at løse den tid, omkostninger, uddannelseskrav, og de ​​fattige repræsentative karakter af laboratoriemodel biofilm systemer i forhold til den virkelige verden miljø, vi for nylig udviklet en høj kapacitet og miljømæssigt germane biofilm 20, (figur 1). Systemet fordele ved brugen af ​​cellefrit puljet humant spyt (CFS) som medium og ubehandlet puljet human bakteriel celle-holdige spyt (CCS) som inokulum. Unikt, at systemet også kombinerer mikrofluid teknologi, et konfokalt laser scanning mikroskop, og kultur-uafhængige bakteriel mangfoldighed analyse teknologi. Således modelsystemet er miljømæssigt germane (ved hjælp af spyt som et inokulum til at vokse flere arter biofilm på 37 ° C i filtersteriliseret flyderspyt) og de ​​mundtlige biofilm indeholder arter (herunder Streptococcus, Neisseria, Veillonella og Porphyromonas arter) i mængderne repræsentative for dem, der findes i begyndelsen supragingival plaque 20. Når man overvejer at dette arbejde beskriver brugen af ​​det nyudviklede model-system, skal man være særlig opmærksom på sammenlægningen af ​​en konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) mikrofluidik, og mangfoldighed analyseteknologier kultur-uafhængig. Foreningen af ​​disse teknologier, som vores forskningsgruppe var tilsigtet og ikke kun tilføjer en high-throughput evne til det nyudviklede model-system, men giver også mulighed spørgsmål at blive spurgt, der ikke kunne være let løses før med andre systemer. Første CLSM har tydelige fordele frem for traditionelle mikroskopi da det giver mulighed for den tredimensionelle analyse af biofilm. Ofte glemmes, det er yderst vigtigt, da biofilm er heterogene with hensyn til artssammensætning og rumlig position samt de fysiologiske forhold pålægges forskellige geografiske steder i biofilmen 6,21. I samråd med tredimensionel gengivelse software og billedanalyse software, biofilmen arkitektur, rumlige forhold mellem komponent arter, og omfanget af antimikrobiel drab kan analyseres 22-24. Sådanne evner er ikke muligt ved hjælp af standard lystransmission eller epifluorescens mikroskopi. Dernæst har mikrofluidik fået særlig opmærksomhed med hensyn til mikrobiologi, da den gør det muligt at studere biofilm under omhyggeligt kontrollerede betingelser (flow, temperatur, pH, etc.) og kræver kun små mængder af væske 25-27. Som et punkt i sammenligning, vokser en mundtlig biofilm i humant spyt i en flow-celle modelsystem (et system, der er velsagtens betragtes som den bærende model for mange orale biofilm undersøgelser) i 20 timer ved en lignende gennemstrømningshastighed og forskydning som der opnåsi en mikrofluidsystem kræver mindst 200 ml, i modsætning til 800 pi i mikrofluid anordning 28-31. Således er en mikrofluid model biofilm system muliggør studiet af kvantitet begrænset materiale under definerede betingelser. Endelig er pyrosekventering teknologi blevet optimeret i de sidste ti år til at kræve kun små mængder af materiale til at foretage et fællesskab analyse og er tilstrækkelig alsidig at styre dybden af ​​sekventering at få identiteten af ​​selv sjældne biofilm arter. Brugen af denne teknologi, såsom bakteriel tag-kodet FLX amplikon pyrosekventering (bTEFAP), har gjort det muligt for relevante spørgsmål vedrørende økologi biofilm, der skal behandles 32,33. Sådanne spørgsmål gennemsyret vanskeligheder i fortiden, når pyrosekventering var ikke tilgængelig på grund af den tid og de ​​omkostninger, der er nødvendige for at skabe plasmid biblioteker og de ​​komplekse teknologiske og analytiske trin, der kræves for at udlede data 33,34. Selvfølgelig en stor fordel med kultur-uafhængig aptilgange, såsom pyrosekventering, er, at de bakterielle arter, der ikke kan dyrkes i isolation i konventionelle laboratorium medier (dvs. levedygtige, men ikke-dyrkbare arter) kan dyrkes og identificeres inden for modellen, og deres relative overflod i samfundet kvantificeret 35, 36 . Hvis du vil tilføje perspektiv, så tidligt som 1963 anslået afdøde Sigmund Socransky at ca. 50% af bakterierne i materiale isoleret fra det menneskelige orale gingival sprække ikke kunne dyrkes under anvendelse vækst laboratorieforhold 37. Formålet med denne metoder papir er at beskrive den tilgang til at udvikle orale flere arter biofilm i en mikrofluid (Bioflux) systemet kommercielt tilgængelige under: (i) betingelserne repræsentative for den menneskelige mundhule og (ii) med en artssammensætning og tæthed, som er sammenlignelig med supragingival plak. Desuden ved hjælp af både freeware og kommerciel software, fremhæve vi hvordan grundlæggende biofilmarkitektur foranstaltninger kan udledes CLSM data, med fokus på metoder til at kvantificere biofilm biomasse, ruhed, og levedygtighed (baseret på live / Dead farvning). Endelig er de nødvendige skridt til at høste biofilm materiale for mangfoldighed analyse af bTEFAP beskrevet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="951">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:525px;">SUPPLIES AND EQUIPMENT</td>
			<td style="width:224px;">AVAILABLE FROM COMPANY</td>
			<td style="width:203px;">CATALOG NUMBER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorval ultracentrifuge&#160; (SS-34 compatible)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Unit-dependent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific SS-34 Rotor&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>28-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific Inc</td>
			<td>23-290-065</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>73520-986&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>NC0542269</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioFlux microfluidic system</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Bioflux 200 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux 24-channel plate</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0004</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SPE or eqivalent system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrosequencing facilities</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Ultra Low Temperature Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips (20, 200, and 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux dedicated software</td>
			<td>Bioflux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica SPE</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COMSTAT/COMSTAT 2</td>
			<td colspan="2">Freeware (http://www.comstat.dk/)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

Der er få high-throughput in vitro systemer, som fremmer udviklingen af flere arter biofilm, der indeholder mange arter almindeligvis påvises inden in vivo orale biofilm. Endvidere et system, der anvender naturligt humant spyt som næringskilde, i stedet for kunstige medier, er særligt ønskeligt for at støtte ekspressionen af cellulære og biofilm-specifikke egenskaber, der efterligner in vivo samfund. Vi beskriver en metode til udvikling af flere arter orale biofilm, som er sammenlignelige med hensyn til artssammensætning, at supragingival plak, under betingelser svarende til det menneskelige mundhulen. Konkret vil dette metoder artikel beskriver, hvordan et kommercielt tilgængeligt mikrofluidsystem kan tilpasses for at fremme udviklingen af ​​flere arter orale biofilm stammer fra og dyrkes i samlet spyt. Endvidere kan en beskrivelse af, hvordan systemet anvendes i forbindelse med en confocal laser scanning mikroskop for at generere 3D-biofilm rekonstruktioner til arkitektoniske og levedygtighed analyser vil blive præsenteret. I betragtning af den brede mangfoldighed af mikroorganismer, der vokser inden biofilm i mikrofluidsystem (herunder Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella og Porphyromonas), vil en protokol også blive præsenteret som beskriver, hvordan man høste biofilm celler til yderligere subkultur eller DNA-ekstraktion og analyse. Grænserne for både microfluidic biofilm, og de nuværende state-of-the-art data analyser vil blive behandlet. I sidste ende, er det forudset, at denne artikel vil give en baseline teknik, der vil forbedre studiet af orale biofilm og støtte i udviklingen af ​​yderligere teknologier, der kan integreres med den mikrofluid platform.

3d rendering af biofilm Repræsentative resultater er vist i figur 3. Et nyttigt værktøj i Imaris software er mulighed for at undersøge hver skive af det indsamlede biofilm stakken og til at kombinere dem for at skabe tredimensionale rekonstruktioner. Desuden kan der tilsættes kunstige shadowing effekter for at hjælpe visuelt fortolke tredimensionale strukturer. De ydede biofilm kan være orienteret i alle retninger med forskellige forstørrels...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms at JoVE.com

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Målet med denne metoder papir er at beskrive anvendelsen af ​​et mikrofluidsystem for udviklingen af ​​multi-arter biofilm, der indeholder arter, typisk identificeret i human supragingival plak. Metoder til at beskrive biofilm arkitektur, biofilm levedygtighed, og en tilgang til høst biofilm for kultur-afhængige eller kultur-uafhængige analyser fremhævet.

Anvendelse af et High-throughput<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrofluidsystem at udvikle Oral Multi-arter biofilm

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematisk analyse af<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Rolling Ved hjælp af en multi-brønds plade Mikrofluid System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Dyrkning af pattedvrceller hjælp af en enkelt brug Pneumatic bioreaktorsystem

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Optimering af brugen af en flydende håndtering Robot til at gennemføre en høj overførselshastighed frem kemiske genetik skærm fra Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Brug af høj overførselshastighed automatiseret Microbioreactor System for produktion af Model IgG1 i CHO celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identifikation af resistens over for Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat ved hjælp af sætteplante Oversvømmelse Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...