Name: use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms
Uploaded: 2014-12-01T15:00:00
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Die Autoren danken William Nance (University of Michigan) um Hilfe bei der Formulierung der Biofilmwachstum Protokolle und Johannes Battista (Fluxion, San Francisco, CA) für die Beratung bei technischen Fragen im Zusammenhang mit der BIOFLUX System. (: R21DE018820 zu AHR NIH) und der University of Michigan Anschubfinanzierung, um AHR Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health

Die hier beschriebene Speichelentnahme Protokoll wurde von der University of Michigan Institutional Review Board für Menschenversuch überprüft. HINWEIS: Im Hinblick auf die institutionelle Bewertungen für menschliche Subjekt der Arbeit dieser Art sollten nach vorheriger Vereinbarung und Berechtigungen von der Gasthochschule sammelte werden. Insbesondere in Abhängigkeit von der Institution, IRB oder Ethik Genehmigung Möglicherweise müssen gesucht und genehmigt werden, bevor Speichelentnahme aus Freiwilligen...

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Diese Methodenpapier hebt die grundlegenden Schritte zur Einrichtung erforderlich und führen Sie ein Mikrofluidsystem in einer Weise, die für die Entwicklung von oralen Multi-Spezies-Biofilme aus gepoolten menschlichen Speichel abgeleitet und in filtersterilisiert 25% gepoolten menschlichen Speichel wachsen lassen. Ansätze, um den Biofilm zu charakterisieren sind, gegeben, aber es sollte daran erinnert werden, dass diese beschriebenen Ansätze modifizierbar sind und zusätzliche Technologien, wie beispielsweise Fleck...

<html> Biofilme sind architektonisch komplexe Gemeinschaften von Bakterien, die auf Oberflächen 1 zusammengefasst sind. Diese Gemeinschaften enthalten typischerweise zahlreiche Arten, die miteinander innerhalb des Biofilms 2 interagieren. Oral Biofilme, die optisch auffälliger als Zahnbelag, sind ein ständiges Problem bei Menschen und ihre unkontrollierte Entwicklung führt zur Erzeugung von taxonomisch diverse Mehrartengemeinschaften 3. Die Komponente Bakterien dieser verschiedenen Gemeinden können bis zu 1.000 Mal resistenter gegen Antibiotika als ihre freischwebenden (Plankton) Gegen 4-6 sein. Die Nichtbeachtung dieser mündlichen Biofilm Gemeinden, die Karies und Parodontitis verursachen können, zu behandeln, hat zu einer erheblichen Belastung der öffentlichen Gesundheit ergeben: mehr als 500 Millionen Besuche in der Zahnarztpraxis pro Jahr in den USA, und ein etwa 108 Milliarden Dollar zur Behandlung oder Vorbeugung von Zahnfleisch Erkrankung und Karies 7. Inhalt &quot;&gt;&quot; Während viele Mikrobiologen befürworten Studium mikrobiellen Verhalten unter natürlichen Bedingungen, einige von ihnen tun. Das ist, weil ihre Moral für die Überwindung der Schwierigkeiten wird ständig von den attraktiven einfache Arbeit mit Laborkulturen. &quot;-Smith 8 geschwächt. Derzeit wird oral Biofilm-Forschung mit einer Vielzahl von in vivo und in vitro Ansätzen durchgeführt, benachteiligt jede mit ihren eigenen Vorteile und 9,10. In-vitro-Ansätze verwenden oft Modell Biofilmsystemen, die relativ einfach zu installieren sind, aber klinische fehlt / realen Welt Relevanz 10,11. In-vivo-Ansätze bei Tiermodellsysteme, die bestimmte Aspekte der menschlichen Mundraum aufgrund der Unterschiede in Anatomie, Physiologie, Mikrobiologie und Immunologie zwischen Tieren vermehren kann, aber wiederum leiden unter Einschränkungen und Menschen 12 der Regel verlassen, 13. Es sollte angemerkt werden, dass die orale Biofilmekann auch auf Email-Oberflächen in einem Stent innerhalb der Mündungen Probanden gehalten entwickelt werden, aber dieser Ansatz ist derzeit relativ aufwendig und arbeitsintensiv, 14,15. Letztlich werden neue Wirkstoffe und Technologien zur Verbesserung der Gesundheitsversorgung Mund beim Menschen unter kontrollierten klinischen Studie Bedingungen 11 getestet. Derzeit ist eine häufig verwendete Vorgehensweise zur Ermittlung und Bewertung neuer Zahnpflegemittel, zuerst durchführen Laborstudien zur möglichen Wirksamkeit zu erkennen, und führen Sie dann Tierversuche und &quot;Feldversuche&quot;, die Ärzte verwenden, um den Erfolg der Technologie 9 auszuwerten, 16,17. Leider neigen Laborstudien an Modellsystemen, die einen großen Platzbedarf besetzen verlassen, sind technologisch anspruchsvolle zu bedienen, und enthalten oft vereinfacht Gemeinden eine oder höchstens einige wenige Arten, potenzielle reale Bedeutung 10,18 abzuleiten. Da Zahnbelag Biofilmen enthalten mehrere Arten und Form in einem komplEx fließt Speichelmilieu, die Entwicklung von Biofilmen, die man selbst oder einige Arten in künstlichen Medien ist unwahrscheinlich, dass Gemeinden, die in einer ähnlichen Weise wie in einem realen Szenario 10,19 verhalten zu generieren. Um die Zeit, Kosten, Ausbildungsanforderungen, und die Armen Repräsentativität der Labormodell Biofilmsystemen im Vergleich zur realen Umgebung anzusprechen, haben wir vor kurzem eine Hochdurchsatz und umwelt Germane Biofilmsystem 20 (Abbildung 1). Diese Systeme profitieren von der Verwendung von zellfreien gepoolten menschlichen Speichel (CFS) als Medium und unbehandeltem menschlichem Mischbakterienzellen enthaltenden Speichel (CCS) als Inokulum. Einzigartig ist, verbindet das System auch Mikrofluidik-Technologie, einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop und kulturunabhängige bakterielle Vielfalt Analysetechnik. Somit ist die Modellsystem umwelt Germane (mit Speichel als ein Inokulum zum Multispezies Biofilme bei 37 wachsen ° C in filtersterilisiert fließtSpeichel) und die orale Biofilme enthalten Arten (einschließlich Streptococcus, Neisseria, Veillonella und Porphyromonas-Spezies) in Häufigkeiten, die den in frühen supragingivale Plaque 20 gefunden. Wenn man bedenkt, dass diese Arbeit beschreibt den Einsatz des neu entwickelten Modellsystem, muss besonderes Augenmerk auf die Zusammenlegung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) Mikrofluidik und kulturunabhängige Vielfalt Analysetechnologien geben. Die Vereinigung dieser Technologien von unserer Arbeitsgruppe beabsichtigt war und nicht nur fügt eine Hochdurchsatzfähigkeit des neu entwickelten Modellsystem, sondern erlaubt auch die Fragen, die gestellt werden, die nicht leicht adressiert werden, bevor mit anderen Systemen werden. Erstens hat CLSM deutliche Vorteile gegenüber traditionellen Mikroskopie, wie es für die dreidimensionale Analyse von Biofilmen. Oft unbeachtet, dies ist äußerst wichtig, da Biofilme heterogene Witzh bezüglich Artenzusammensetzung und räumliche Lage sowie die physiologischen Bedingungen an unterschiedlichen räumlichen Stellen innerhalb des Biofilms 6,21 auferlegt. Zusammen mit dreidimensionalen Rendering-Software und Bildanalyse-Software, die Biofilmarchitektur räumlichen Beziehungen zwischen Komponentenarten, und das Ausmaß der antimikrobiellen Abtötung analysiert 22-24 werden. Solche Fähigkeiten sind nicht mit Standard-Durchlicht oder Epifluoreszenzmikroskopie. Weiter hat Mikrofluidik insbesondere Aufmerksamkeit erregt auf dem Gebiet der Mikrobiologie es ermöglicht die Untersuchung von Biofilmen unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen (Durchfluss, Temperatur, pH, etc.) und erfordert nur kleine Flüssigkeitsvolumina 25-27. Als Vergleichspunkt, Aufwachsen einer oralen Biofilm im menschlichen Speichel innerhalb einer Durchflußzelle Modellsystem (ein System, die wohl als die Hauptstütze Modell für viele oral Biofilm Studien wird) für 20 h bei einer ähnlichen Strömungsrate und Scher wie diejenige erreichtin einem mikrofluidischen System erfordert mindestens 200 ml, im Gegensatz zu 800 &amp; mgr; l in der mikrofluidischen Vorrichtung 28-31. Auf diese Weise ermöglicht ein Mikrofluidik-Modell Biofilmsystem das Studium der Menge begrenzte Material unter definierten Bedingungen. Schließlich hat Pyrosequenzierungstechnologie im letzten Jahrzehnt optimiert, dass nur geringe Mengen an Material erfordern, um eine Gemeinschaft Analyse durchzuführen, und ist vielseitig genug, um Tiefe von der Ablaufsteuerung, um die Identität auch seltene Biofilmspezies erhalten. Der Einsatz dieser Technologie, wie bakterielle Tag-kodierte FLX Amplikon Pyrosequenzierung (bTEFAP) hat für relevante Fragen der Ökologie von Biofilmen dürfen angesprochen 32,33 werden. Solche Fragen durchdrungen Schwierigkeiten in der Vergangenheit, wenn Pyrosequenzierung war nicht verfügbar, da der benötigten Zeit und Plasmid-Bibliotheken und die komplexen technischen und Analyseschritte erforderlich, um Daten abzuleiten 33,34 verursachten Kosten. Natürlich ist ein großer Vorteil, mit kulturunabhängige apAnsätze, wie Pyrosequenzierung, ist, dass die Bakterienspezies, die nicht isoliert innerhalb der üblichen Labormedien (dh lebensfähigen, aber nicht-kultivierbaren Arten) gezüchtet werden können, können gezüchtet und identifiziert innerhalb der Modellsystem und ihre relative Häufigkeit in der Community quantitativ 35, 36 . Um Sicht bereits 1963 hinzufügen schätzte die späten Sigmund Socransky dass etwa 50% der Bakterien im Material von der menschlichen Mund Sulkus isoliert nicht mit Laborwachstumsbedingungen 37 kultiviert werden. Das Ziel dieser Arbeit ist es, Methoden Beschreibung des Ansatzes zur oralen Multi-Spezies-Biofilmen in einem handelsüblichen Mikrofluid (BIOFLUX) Systems unter sich bilden: (i) Bedingungen repräsentativ für die menschliche Mundhöhle und (ii) mit einem Artenzusammensetzung und Fülle, ist vergleichbar mit supragingivale Plaque. Darüber hinaus verwenden sowohl Freeware und kommerzielle Software, markieren wir, wie Grund BiofilmArchitektur Maßnahmen von CLSM Daten abgeleitet werden, wobei der Schwerpunkt auf Ansätze zur Biofilm Biomasse, Rauheit, und Lebensfähigkeit zu quantifizieren (basierend auf Live / Dead-Färbung). Schließlich werden die erforderlich ist, um Biofilm Material für Vielfalt Analyse bTEFAP ernten Schritten beschrieben.

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			<td height="20" style="height:20px;width:525px;">SUPPLIES AND EQUIPMENT</td>
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		</tr>
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			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorval ultracentrifuge&#160; (SS-34 compatible)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Unit-dependent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific SS-34 Rotor&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>28-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific Inc</td>
			<td>23-290-065</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>73520-986&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>NC0542269</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioFlux microfluidic system</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Bioflux 200 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux 24-channel plate</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0004</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SPE or eqivalent system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrosequencing facilities</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Ultra Low Temperature Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips (20, 200, and 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux dedicated software</td>
			<td>Bioflux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica SPE</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COMSTAT/COMSTAT 2</td>
			<td colspan="2">Freeware (http://www.comstat.dk/)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

Es gibt nur wenige Hochdurch in vitro-Systeme, die die Entwicklung von Multi-Spezies in Biofilmen zahlreiche Arten üblicherweise in in vivo oral Biofilmen detektiert enthalten erleichtern. Darüber hinaus ist ein System, das natürliche humane Speichel verwendet als Nährstoffquelle, statt künstlicher Medien, um die Expression von zellulären und Biofilm-spezifische Eigenschaften, die in vivo nachahmen Gemeinschaften unterstützt besonders wünschenswert. Wir beschreiben ein Verfahren für die Entwicklung von Mehrarten oralen Biofilmen, die vergleichbar sind, mit Bezug auf die Artenzusammensetzung, um Zahnbelag supragingivalen, unter ähnlichen Bedingungen wie die menschliche Mundhöhle. Genauer gesagt, wird diese Methoden Artikel beschreiben, wie ein im Handel erhältlicher Mikrofluidsystem kann angepasst werden, um die Entwicklung von Multi-Spezies orale Biofilme abgeleitet erleichtern und innerhalb gepoolt Speichel gezüchtet. Darüber hinaus kann eine Beschreibung, wie das System in Verbindung mit einem confoca verwendet werdenl Laserabtastmikroskop zur 3-D Biofilm Rekonstruktionen für architektonische und Lebensfähigkeit Analysen erzeugen vorgestellt. Angesichts des breiten Vielfalt von Mikroorganismen, die in Biofilmen in der mikrofluidischen Systems (einschließlich Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella und Porphyromonas) wachsen, wird ein Protokoll auch beschreiben, wie Sie die Biofilm-Zellen für die weitere Subkultur oder DNA-Extraktion und Analyse Ernte vorgelegt werden. Die Grenzen sowohl der Mikrofluidik Biofilm System und die aktuellen State-of-the-art Datenanalysen angesprochen. Letztlich ist es vorstellbar, dass dieser Artikel eine Basistechnik, die die Untersuchung der oralen Biofilmen verbessern und helfen bei der Entwicklung von weiteren Technologien, die mit dem Mikrofluid-Plattform integriert werden können, bereitzustellen.

3D-Rendering von Biofilmen Repräsentative Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Ein nützliches Werkzeug in Imaris Software ist die Möglichkeit, jede Scheibe des gesammelten Biofilm Stapel zu untersuchen und zu kombinieren, um dreidimensionale Rekonstruktionen zu erstellen. Zusätzlich können künstliche Abschattungseffekte hinzugefügt werden visuell zur Interpretation dreidimensionalen Strukturen. Die erbrachten Biofilmen kann in jede Richtung mit unte...

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Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

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Biotechnik

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

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A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

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To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

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Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

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Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

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Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...