Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00
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We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

1. Croissance de cellules de levure <ol><li> Ensemencer les cellules de levure dans 30 ml de YPD (tableau 1) dans un petit flacon. Incuber à 30 ° C pendant la nuit avec agitation. </li><li> Diluer les cellules à une densité optique de 0,2 à 600 nm (DO 600 = 0,2) dans 50 ml de YPD et incuber à 30 ° C avec agitation par secousses. </li><li> Cultiver la culture jusqu&#39;à une densité optique de 1,0 à 600 nm (DO 600 = 1,0). </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min ...

<ol>
	<li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-1:+Ubiquitin+gains+weight.">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li><li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4.">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li><li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain.">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li><li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis.">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mub1/Ubr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein.">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).</li><li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast.">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li><li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p.">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li><li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase.">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li><li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation.">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase-promoting+complex/cyclosome+controls+HEC1+stability.">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li><li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIZ1/SIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II.">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li><li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158 (2007).</li><li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li><li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+assembly:+if+you+build+it,+they+will+come.">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li></ol>

marqueurs d&#39;épitopes tels que HA, Myc, Drapeau, et la TPS sont largement utilisés pour l&#39;analyse biochimique des protéines. Construction de souches avec HF-Smt3 et protéines kinétochoriens marqué par myc, comme Ndc10 et Ndc80, facilite la détection des PTM tels que la sumoylation et ubiquitination. HF-Smt3 déroulant test permet la détection de protéines kinétochoriens sumoylated, Ndc10 et Ndc80 (Figure 1). Le protocole de purification par affinité et analyse western blot en utilisant...

L&#39;ubiquitination et sumoylation permettent la conjugaison de l&#39;ubiquitine et le modificateur de petite ubiquitine (SUMO; Smt3 dans S. cerevisiae 1) à une protéine cible, respectivement. PTM de protéines kinétochoriens affectent leurs niveaux cellulaires et des interactions protéine-protéine au cours des différentes phases du cycle cellulaire afin d&#39;assurer la ségrégation des chromosomes fidèle. Par exemple, les niveaux cellulaires de CSE4 / CENP-A et la protéine de kinetochore extérieure DSN1 sont réglementés par protéolyse ubiquitine pour assurer la stabilité du génome 2-5. La déstabilisation de équipements kinétochoriens-microtubules incorrectes nécessite la kinase B IPL1 / Aurora, qui phosphoryle et complexes Dam1 Ndc80 qui interagissent directement avec les microtubules 8.6. Malgré l&#39;identification de plus de soixante-dix protéines kinétochoriens, il ya très peu d&#39;études qui examinent les modifications de ces protéines avec PTM, par exemple, l&#39;ubiquitine et SUMO. Une limitation importante est la capacité à préserver la PTMs pendant la purification et la rareté des anticorps sur mesure pour la détection de la sumoylation PTM tels que, la phosphorylation, la méthylation, et d&#39;autres. Caractérisation des protéines kinétochoriens sumoylated Ndc10, CEP3, BIR1 et Ndc80 utilisé un anticorps personnalisé 9. En outre, Ndc10 a été impliquée en tant que substrat pour l&#39;ubiquitination 10. HEC1 humain (Ndc80 chez S. cerevisiae) est également substrat pour ubiquitination, réglementé par APC / C-hCdh1 ligase E3 11. Par conséquent, Ndc10 et Ndc80 sont de bons candidats pour l&#39;optimisation du protocole de détecter à la fois la sumoylation et ubiquitination en S. cerevisiae. Pour faciliter l&#39;identification de la sumoylation, nous avons construit des souches qui expriment HF-Smt3 et Myc-tagged Ndc10 ou Ndc80. L&#39;utilisation de marqueurs d&#39;epitope (HF: His6-Flag) minimise le bruit de fond dû à la réactivité croisée qui est fréquemment observé dans le sérum polyclonal dirigé contre une protéine candidate. Nous avons élaboré un protocole d&#39;affinitépurifier les conjugués HF-SMT3 commercial et ensuite utilisé des anticorps anti-Myc et anti-Flag pour détecter la présence de sumolyated Ndc10 et Ndc80 dans la préparation purifiée Smt3. Pour ubiquitination, nous avons conçu un protocole d&#39;immunoprécipitation modifiée qui conserve ubiquitination des protéines kinétochoriens marqué par myc et effectué une analyse western blot avec un anticorps commercial anti-Ub pour détecter ubiquitination de Ndc10 et Ndc80.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td align="right">11079105</td>
			<td>0.5 mm dia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini beadbeater</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>#693</td>
			<td>8 cell disrupter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">30430</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7470</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-Myc antibody (A-14)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-789</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-150P</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-258R</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2001</td>
			<td>0.45 mm pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>1.0 mm, 10 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">34078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH7.4</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue sensitive X-Ray film</td>
			<td>Dbio</td>
			<td>DBOF30003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic developer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>M35AX-OMAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2619</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

Les modifications post-traductionnelles (PTM), tels que la phosphorylation, la méthylation, l&#39;acétylation, l&#39;ubiquitination, et sumoylation, régulent la fonction cellulaire de nombreuses protéines. PTM de protéines kinétochoriens qui associent avec l&#39;ADN centromérique médiation ségrégation des chromosomes fidèle à maintenir la stabilité du génome. Approches biochimiques telles que la spectrométrie de masse et analyse western blot sont les plus couramment utilisés pour l&#39;identification des PTM. Ici, un procédé de purification des protéines est décrite qui permet la détection à la fois de la sumoylation et ubiquitination des protéines kinétochoriens, Ndc10 et Ndc80, dans Saccharomyces cerevisiae. Une souche qui exprime polyhistidine-marquage Flag Smt3 (HF-Smt3) et marqué par myc Ndc10 ou Ndc80 a été construit et utilisé pour nos études. Pour la détection de la sumoylation, nous avons conçu un protocole pour purifier par affinité les protéines His-étiqueté sumoylated à l&#39;aide de billes de nickel et utilisé une analyse western blot avec un anticorps anti-Myc pour détecter une sumoylated Ndc10e Ndc80. Pour la détection de l&#39;ubiquitination, nous avons élaboré un protocole pour l&#39;immunoprécipitation des protéines Myc-marqués et utilisé l&#39;analyse de western blot avec l&#39;anticorps anti-Ub pour montrer que Ndc10 et Ndc80 sont ubiquitinées. Nos résultats montrent que l&#39;épitope protéine marquée de l&#39;intérêt pour l&#39;His-Drapeau étiqueté souche Smt3 facilite la détection de plusieurs PTM. Les études futures devraient permettre une exploitation de cette technique pour identifier et caractériser les interactions entre protéines qui sont tributaires d&#39;un PTM spécifique.

Pour détecter sumoylation de protéines kinétochoriens Ndc80 et Ndc10, les souches avec HF-Smt3 et protéines kinétochoriens marqué par myc (Ndc80 ou Ndc10) ont été construits (tableau 2), comme décrit précédemment 9,12. Conjugués HF-SMT3 ont été purifiés par affinité en utilisant des billes de Ni-NTA. Analyse par Western blot purifié HF-Smt3 avec un anticorps anti-Flag a permis la détection de formes sumoylated de substrats SUMO qui étaient absentes dans la souche de contrô...

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Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Ce manuscrit décrit la détection de la sumoylation de protéines et ubiquitination kinétochoriens, Ndc10 Ndc80 et, dans le bourgeonnement levure Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

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