Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

खमीर कोशिकाओं के 1. ग्रोथ <ol><li> एक छोटी सी कुप्पी में YPD (तालिका 1) के 30 मिलीलीटर में खमीर की कोशिकाओं को टीका लगाना। झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। </li><li> YPD के 50 मिलीलीटर में 600 एनएम (6...

<ol>
	<li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-1:+Ubiquitin+gains+weight.">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li><li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4.">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li><li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain.">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li><li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis.">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mub1/Ubr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein.">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).</li><li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast.">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li><li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p.">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li><li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase.">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li><li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation.">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase-promoting+complex/cyclosome+controls+HEC1+stability.">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li><li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIZ1/SIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II.">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li><li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158 (2007).</li><li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li><li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+assembly:+if+you+build+it,+they+will+come.">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li></ol>

इस तरह हा, Myc, ध्वज, और जीएसटी के रूप में मिलान टैग व्यापक रूप से प्रोटीन की जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। HF-Smt3 और इस तरह के Ndc10 और Ndc80 के रूप में Myc टैग kinetochore प्रोटीन, साथ उपभेदों का निर्माण, ऐसे...

क्रमश: एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए, (एस cerevisiae 1 में Smt3 सूमो) Ubiquitination और sumoylation ubiquitin और लघु Ubiquitin की तरह संशोधक का संयुग्मन अनुमति देते हैं। Kinetochore प्रोटीन की PTMs वफादार गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करने के लिए अलग सेल चक्र चरणों के दौरान उनके सेलुलर स्तर और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, Cse4 / CENP-ए और बाहरी kinetochore प्रोटीन Dsn1 की सेलुलर स्तर जीनोम स्थिरता 2-5 सुनिश्चित करने के लिए ubiquitin की मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस द्वारा विनियमित रहे हैं। गलत kinetochore-सूक्ष्मनलिका अनुलग्नकों की अस्थिरता सीधे सूक्ष्मनलिकाएं 6-8 के साथ बातचीत कि Dam1 और Ndc80 परिसरों phosphorylates जो Ipl1 / अरोड़ा बी काइनेज की आवश्यकता है। सत्तर से अधिक kinetochore प्रोटीन की पहचान के बावजूद, PTMs, जैसे, Ubiquitin और सूमो के साथ इन प्रोटीनों की संशोधनों की जांच है कि बहुत कुछ अध्ययन कर रहे हैं। एक प्रमुख सीमा PTM की रक्षा करने की क्षमता हैशुद्धि और इस तरह के sumoylation, फास्फारिलीकरण, मेथिलिकरण, और दूसरों के रूप में PTMs का पता लगाने के लिए कस्टम एंटीबॉडी की कमी के दौरान एस। Sumoylated kinetochore प्रोटीन की विशेषता Ndc10, Cep3, Bir1, और Ndc80 एक कस्टम एंटीबॉडी 9 का उपयोग किया। इसके अतिरिक्त, Ndc10 ubiquitination 10 के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में शामिल किया गया है। मानव Hec1 (एस cerevisiae में Ndc80) भी एपीसी / सी-hCdh1 E3 के ligase 11 द्वारा विनियमित, ubiquitination के लिए सब्सट्रेट है। इसलिए, Ndc10 और Ndc80 एस में sumoylation और ubiquitination दोनों का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए अच्छा उम्मीदवार हैं cerevisiae। Sumoylation की पहचान की सुविधा के लिए, हम HF-Smt3 और Myc टैग Ndc10 या Ndc80 व्यक्त कि उपभेदों का निर्माण किया। मिलान टैग (HF: His6-ध्वज) के उपयोग की वजह से अक्सर एक उम्मीदवार प्रोटीन के खिलाफ उठाया पॉलीक्लोनल सीरम में मनाया जाता है कि पार जेट के लिए पृष्ठभूमि को कम करता है। हम समानता के लिए एक प्रोटोकॉल तैयारHF-Smt3 conjugates के शुद्ध और फिर शुद्ध Smt3 तैयारी में sumolyated Ndc10 और Ndc80 की उपस्थिति का पता लगाने के लिए वाणिज्यिक विरोधी ध्वज और विरोधी Myc एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। Ubiquitination के लिए, हम Myc टैग kinetochore प्रोटीन की ubiquitination को बरकरार रखता है कि एक संशोधित immunoprecipitation प्रोटोकॉल तैयार कर लिया और Ndc10 और Ndc80 की ubiquitination का पता लगाने के लिए वाणिज्यिक विरोधी-UB एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शन किया।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td align="right">11079105</td>
			<td>0.5 mm dia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini beadbeater</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>#693</td>
			<td>8 cell disrupter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">30430</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7470</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-Myc antibody (A-14)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-789</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-150P</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-258R</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2001</td>
			<td>0.45 mm pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>1.0 mm, 10 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">34078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH7.4</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue sensitive X-Ray film</td>
			<td>Dbio</td>
			<td>DBOF30003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic developer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>M35AX-OMAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2619</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

इस तरह के फास्फारिलीकरण, मेथिलिकरण, एसिटिलीकरण, ubiquitination, और sumoylation के रूप में बाद translational संशोधनों (PTMs), कई प्रोटीन के सेलुलर समारोह को विनियमित। Centromeric डीएनए के साथ संबद्ध है कि kinetochore प्रोटीन की PTMs जीनोम स्थिरता बनाए रखने के लिए वफादार गुणसूत्र अलगाव मध्यस्थता। ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के रूप में जैव रासायनिक दृष्टिकोण आमतौर पर सबसे अधिक PTMs की पहचान के लिए किया जाता है। इधर, एक प्रोटीन शोधन विधि Saccharomyces cerevisiae में kinetochore प्रोटीन, Ndc10 और Ndc80 के sumoylation और ubiquitination दोनों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है कि वर्णित है। Ndc10 Myc टैग या Ndc80 निर्माण किया है और हमारे अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था व्यक्त करता polyhistidine फ्लैग टैग Smt3 (HF-Smt3) और कहा कि एक तनाव। Sumoylation का पता लगाने के लिए, हम निकल मोती का उपयोग करके अपने टैग sumoylated प्रोटीन शुद्ध आत्मीयता के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार कर लिया और sumoylated Ndc10 एक का पता लगाने के विरोधी Myc एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का इस्तेमाल कियाएन डी Ndc80। Ubiquitination का पता लगाने के लिए, हम Myc टैग प्रोटीन की immunoprecipitation के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार कर लिया और Ndc10 और Ndc80 ubiquitinated कर रहे हैं दिखाने के लिए कि विरोधी-UB एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का इस्तेमाल किया। हमारे परिणाम उनकी फ्लैग में रुचि के मिलान में चिह्नित प्रोटीन Smt3 तनाव कई PTMs का पता लगाने की सुविधा में चिह्नित है दिखाते हैं। भविष्य के अध्ययन के लिए इस तकनीक का शोषण एक विशिष्ट PTM पर निर्भर कर रहे हैं कि प्रोटीन बातचीत की पहचान करने और चिह्नित करने के लिए अनुमति चाहिए।

पहले से 9,12 के रूप में वर्णित kinetochore प्रोटीन Ndc80 और Ndc10 की sumoylation का पता लगाने के लिए, HF-Smt3 और Myc टैग kinetochore प्रोटीन (Ndc80 या Ndc10) के साथ उपभेदों, (तालिका 2) का निर्माण किया गया। HF-Smt3 conjugates के संबंध नी NTA मोती का उपयोग कर श?...

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Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

इस पांडुलिपि नवोदित खमीर में, sumoylation और kinetochore प्रोटीन, Ndc10 और Ndc80 की ubiquitination का पता लगाने का वर्णन है।

Sumoylation और नवोदित खमीर Kinetochore प्रोटीन Ndc10 और Ndc80 की Ubiquitination की जांच की अनुमति देता है कि प्रोटीन शोधन तकनीक

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

नवोदित खमीर में Replicative लाइफ स्पैन मापने

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Detection of Protein Ubiquitination

प्रोटीन ubiquitination की जांच

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

कार्बनिक सॉल्वेंट और एसिटिक एसिड के बिना जी 250 Coomassie के साथ जैल में प्रोटीन की धुंधला

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria के खमीर कक्ष से शोधन

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

नवोदित खमीर में प्रोटीन कांसंट्रेशन की एक फंक्शन के रूप एक morphological Phenotype के विकास विश्लेषण

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 के शोधन, एक प्रोटीन Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

अति सक्रिय खमीर Ribosomes के chromatographic शोधन

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

नवोदित खमीर की प्रतिदीप्ति समय चूक सिनेमा हासिल करना और grafts का उपयोग कर एकल सेल गतिशीलता का विश्लेषण

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

समारोह का अध्ययन है, सहभागिता, और बाद translational संशोधनों के लिए नवोदित खमीर प्रोटीन निष्कर्षण और शोधन

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

झिल्ली प्रोटीन की हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग में<em&gt; Escherichia कोलाई</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...