Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

1. La crescita di cellule di lievito <ol><li> Inoculare cellule di lievito in 30 ml di YPD (Tabella 1) in un palloncino. Incubare a 30 ° C per una notte con agitazione. </li><li> Diluire le cellule ad una densità ottica di 0,2 a 600 nm (OD 600 = 0.2) in 50 ml di YPD e incubare a 30 ° C con agitazione. </li><li> Crescere la coltura ad una densità ottica di 1,0 a 600 nm (OD 600 = 1.0). </li><li> Celle di centrifugazione per 5 min a 2000 xg e scartare il surnatante. </li><li> Ri...

<ol>
	<li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-1:+Ubiquitin+gains+weight.">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li><li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4.">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li><li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain.">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li><li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis.">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mub1/Ubr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein.">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).</li><li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast.">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li><li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p.">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li><li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase.">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li><li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation.">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase-promoting+complex/cyclosome+controls+HEC1+stability.">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li><li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIZ1/SIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II.">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li><li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158 (2007).</li><li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li><li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+assembly:+if+you+build+it,+they+will+come.">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li></ol>

Tag epitopo quali HA, Myc, Bandiera, e GST sono ampiamente utilizzati per l&#39;analisi biochimica delle proteine. Costruzione di ceppi con HF-Smt3 e proteine ​​cinetocore Myc-tag, come Ndc10 e Ndc80, facilita l&#39;individuazione di PTM, come sumoilazione e ubiquitinazione. HF-Smt3 tirare giù test permette la rilevazione di proteine ​​cinetocore sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). Il protocollo di purificazione per affinità e western blot utilizzando un anticorpo anti-Flag stabilire la spec...

Ubiquitinazione e sumoilazione permettono la coniugazione di ubiquitina e Modifier Piccolo ubiquitina-simile (SUMO, Smt3 in S. cerevisiae 1) ad una proteina bersaglio, rispettivamente. PTM di proteine ​​cinetocore influenzano i livelli cellulari e interazioni proteina-proteina durante le diverse fasi del ciclo cellulare per garantire fedele segregazione dei cromosomi. Ad esempio, i livelli cellulari di Cse4 / CENP-A e proteine ​​cinetocore esterno DSN1 sono regolate da proteolisi ubiquitina-mediata per garantire la stabilità del genoma 2-5. Destabilizzazione degli allegati cinetocore-microtubuli non corretti richiede la B chinasi Ipl1 / Aurora, che fosforila Dam1 e Ndc80 complessi che interagiscono direttamente con i microtubuli 6-8. Nonostante l&#39;identificazione di oltre settanta proteine ​​cinetocore, ci sono molto pochi gli studi che indagano le modifiche di queste proteine ​​con PTM, ad esempio, l&#39;ubiquitina e SUMO. Una limitazione importante è la capacità di conservare la PTMs durante la purificazione e la scarsità di anticorpi personalizzati per la rilevazione di PTM come sumoylation, fosforilazione, metilazione, e altri. Caratterizzazione di proteine ​​cinetocore sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizzato un anticorpo personalizzato 9. Inoltre, Ndc10 è stata implicata come substrato per 10 ubiquitinazione. Hec1 umana (Ndc80 in S. cerevisiae) è anche substrato per ubiquitinazione, regolato da APC / C-hCdh1 E3 ligasi 11. Pertanto, Ndc10 e Ndc80 sono buoni candidati per l&#39;ottimizzazione del protocollo per rilevare sia sumoilazione e ubiquitinazione in S. cerevisiae. Per facilitare l&#39;individuazione di sumoilazione, abbiamo costruito i ceppi che esprimono HF-Smt3 e Myc-tag Ndc10 o Ndc80. L&#39;uso di tag epitopi (HF: His6-Flag) riduce al minimo il fondo a causa della cross-reattività che è frequente nel siero policlonale sollevata contro una proteina candidato. Abbiamo ideato un protocollo per affinitàpurificare coniugati HF-Smt3 e poi utilizzati commerciale anti-Flag e anticorpi anti-myc per rilevare la presenza di sumolyated Ndc10 e Ndc80 nella preparazione Smt3 purificato. Per ubiquitination, abbiamo ideato un protocollo immunoprecipitazione modificata che conserva ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore Myc-targhette e svolta western blot con l&#39;anticorpo commerciale anti-Ub per rilevare ubiquitinazione di Ndc10 e Ndc80.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td align="right">11079105</td>
			<td>0.5 mm dia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini beadbeater</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>#693</td>
			<td>8 cell disrupter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">30430</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7470</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-Myc antibody (A-14)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-789</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-150P</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-258R</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2001</td>
			<td>0.45 mm pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>1.0 mm, 10 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">34078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH7.4</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue sensitive X-Ray film</td>
			<td>Dbio</td>
			<td>DBOF30003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic developer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>M35AX-OMAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2619</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

Modificazioni post-traduzionali (PTM), come fosforilazione, metilazione, acetilazione, ubiquitinazione e sumoilazione, regolano la funzione cellulare di molte proteine. PTM di proteine ​​cinetocore che associano con il DNA centromerico mediano fedele segregazione dei cromosomi per mantenere la stabilità del genoma. Approcci biochimici come la spettrometria di massa e analisi di western blot sono più comunemente utilizzati per l&#39;identificazione di PTM. Qui, un metodo di purificazione della proteina è descritto che permette il rilevamento di entrambe sumoylation e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. Un ceppo che esprime polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) e Myc-tagged Ndc10 o Ndc80 è stato costruito e utilizzato per i nostri studi. Per il rilevamento di sumoylation, abbiamo ideato un protocollo per affinità purificare proteine ​​sumoylated His-tagged utilizzando perline di nichel e usato western blot con anticorpi anti-Myc per rilevare sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Per il rilevamento di ubiquitinazione, abbiamo ideato un protocollo per immunoprecipitazione di proteine ​​Myc-tag e utilizzato analisi Western Blot con anticorpi anti-Ub per dimostrare che Ndc10 e Ndc80 sono ubiquitinate. I nostri risultati mostrano che epitopi di proteine ​​tag di interesse per il suo-Flag tagged ceppo Smt3 facilita l&#39;individuazione di molteplici PTM. Studi futuri dovrebbero consentire lo sfruttamento di questa tecnica per identificare e caratterizzare le interazioni proteina che dipendono da uno specifico PTM.

Per rilevare sumoylation di proteine ​​cinetocore Ndc80 e Ndc10, ceppi con HF-Smt3 e proteine ​​cinetocore Myc-tag (Ndc80 o Ndc10) sono stati costruiti (Tabella 2), come descritto in precedenza 9,12. Coniugati HF-Smt3 stati affinità purificate utilizzando Ni-NTA perline. Analisi Western blot di purificato HF-Smt3 con un anticorpo anti-Flag permesso rilevamento di forme sumoylated di substrati SUMO che erano assenti nel ceppo di controllo senza HF-Smt3 (Figura 1A e <s...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Durata pannello misura replicazione in lievito

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Ricerca

Biologia

Detection of Protein Ubiquitination

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito Highly Active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

L&#39;acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Purificazione delle proteine tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine Ndc10 e Ndc80