Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00
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We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

효모 세포의 성장 (1) <ol><li> 작은 플라스크에 YPD (표 1) 30 ㎖에 효모 세포를 접종한다. 진탕 30 ℃에서 밤새 품어. </li><li> YPD 50ml에 600 나노 미터 (600 OD = 0.2)에서 0.2의 광학 밀도로 세포를 희석하고, 진탕하면서 30 ℃에서 배양한다. </li><li> 600 nm의 (OD 600 = 1.0)에서 1.0의 광학 밀도 문화를 성장. </li><li> 원심 분리기 세포 2,000 XG에 5 분 동안 상층 액을 버린다. </li><li> 세포를 ...

<ol>
	<li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-1:+Ubiquitin+gains+weight.">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li><li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4.">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li><li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain.">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li><li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis.">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mub1/Ubr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein.">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).</li><li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast.">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li><li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p.">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li><li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase.">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li><li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation.">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase-promoting+complex/cyclosome+controls+HEC1+stability.">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li><li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIZ1/SIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II.">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li><li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158 (2007).</li><li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li><li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+assembly:+if+you+build+it,+they+will+come.">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li></ol>

이러한 HA, Myc와, 플래그 및 GST와 같은 에피토프 태그 널리 단백질의 생화학 적 분석을 위해 사용된다. HF-Smt3 및 Ndc10 Ndc80과 같은 나 Myc 태그가 동원체 단백질과 균주의 구성은 이러한 sumoylation 유비퀴틴과 같은 PTMS의 검출을 용이하게한다. HF-Smt3 분석를 풀다운는 sumoylated 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80 (그림 1)의 검출을 할 수 있습니다. 안티 - 플래그 항체를 이용하여 친 화성 정화 프로토?...

각각 표적 단백질에 (S. cerevisiae의 1 Smt3 SUMO) 유비퀴틴과 sumoylation는 유비퀴틴과 작은 유비퀴틴 같은 수정의 활용을 할 수 있습니다. 동원체 단백질 PTMS 충실한 염색체 분리를 보장하기 위해 상이한 세포주기 단계에서 자신의 세포 수준 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 영향을 미친다. 예를 들어, Cse4 / CENP-A 및 외부 동원체 단백질 Dsn1의 세포 수준 게놈 안정성 2-5을 보장하기위한 유비퀴틴 매개 단백질 분해에 의해 조절된다. 잘못된 동원체 - 미세 소관 첨부 불안정 직접 미세 소관 6-8과 상호 작용 Dam1과 Ndc80 단지를 인산화 Ipl1 / 오로라 B 키나제가 필요합니다. 일흔을 통해 동원체 단백질의 확인에도 불구하고, PTMS, 예를 들어, 유비퀴틴과 SUMO 이러한 단백질의 변형을 조사 거의 연구가있다. 주요한 제한은 PTM을 보존하는 능력이다정화 및 sumoylation, 인산화, 메틸화, 등과 같은 PTMS의 검출을위한 사용자 정의 항체의 소수 중의. sumoylated 동원체 단백질의 특성은 Ndc10, Cep3는 Bir1 및 Ndc80 사용자 정의 항체 (9)를 이용했다. 또한 Ndc10 유비퀴틴은 10 기재로서 연루되어왔다. 인간 Hec1 (S. cerevisiae의에서 Ndc80)도 APC / C-hCdh1 E3 리가 아제 (11)에 의해 규제, 유비퀴틴 화를 위해 기판이다. 따라서, Ndc10 및 Ndc80는 S.에서 sumoylation 및 유비퀴틴을 모두 감지 할 수있는 프로토콜의 최적화를위한 좋은 후보입니다 cerevisiae의. sumoylation의 식별을 용이하게하기 위해, 우리는 HF-Smt3 및 Myc와 태그가 Ndc10 또는 Ndc80을 표현 균주를 건설했다. 에피토프 태그 (HF :을 His6-FLAG)의 사용으로 인해 자주 후보 단백질에 대해 발생하는 폴리 클로 날 혈청에서 관찰되고 교차 반응의 배경을 최소화한다. 우리는 선호도와 프로토콜을 고안HF-Smt3 접합체를 정제 한 다음 정제 Smt3 제제 sumolyated Ndc10 및 Ndc80의 존재를 검출하기 위해 상업적 방지 플래그 및 안티 나 Myc 항체를 사용 하였다. 유비퀴틴을 위해, 우리는 Myc와 태그가 동원체 단백질의 유비퀴틴 화를 보존하는 변형 된 면역 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지하는 상업 항 UB 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td align="right">11079105</td>
			<td>0.5 mm dia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini beadbeater</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>#693</td>
			<td>8 cell disrupter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">30430</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7470</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-Myc antibody (A-14)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-789</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-150P</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-258R</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2001</td>
			<td>0.45 mm pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>1.0 mm, 10 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">34078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH7.4</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue sensitive X-Ray film</td>
			<td>Dbio</td>
			<td>DBOF30003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic developer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>M35AX-OMAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2619</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

이러한 인산화, 메틸화, 아세틸 화, 유비퀴틴 및 sumoylation 같은 번역 후 변형 (PTMS)는, 많은 단백질의 세포 기능을 조절한다. 센트로 DNA와 연관 동원체 단백질의 PTMS는 유전체의 안정성을 유지하기 위해 충실한 염색체 분리를 중재. 같은 질량 분석 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 생화학 적 접근 방법이 가장 일반적으로 PTMS의 식별을 위해 사용된다. 여기서, 단백질의 정제 방법은, 사카로 마이 세스 세레 비지에 동원체 단백질 Ndc10 및 Ndc80의 sumoylation 및 유비퀴틴 양쪽의 검출을 허용하는 기술된다. Ndc10 Myc와 - 태그 또는 Ndc80가 건설하고 우리의 연구에 사용 된 표현 폴리 히스티딘 플래그 태그가 Smt3 (HF-Smt3) 및 변형. sumoylation의 검출을 위해, 우리는 니켈 비드를 사용하여 자신 태깅 sumoylated 단백질을 정제 친화력 프로토콜을 고안 sumoylated Ndc10 A를 검출하기 위해 항 - 나 Myc 항체로 웨스턴 블롯 분석을 이용ND Ndc80. 유비퀴틴의 검출을 위해, 우리는 Myc와 태그가 단백질의 면역을위한 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80이가 도처 것을 보여 방지 UB 항체와 웨스턴 블롯 분석을 사용했다. 우리의 결과는 그의 플래그에 대한 관심의 에피토프 태그 단백질이 Smt3 변형 여러 PTMS의 검출을 용이하게 태그를 보여줍니다. 앞으로의 연구는이 기술의 개발은 특정 PTM에 의존 단백질 상호 작용을 식별하고 특성화 할 수 있도록해야한다.

이전에 설명 된대로 9,12- 동원체 단백질과 Ndc80 Ndc10의 sumoylation을 검출하도록, HF-Myc와 Smt3 및 태깅 동원체 단백질 (또는 Ndc80 Ndc10)와 균주 (표 2)를 구성 하였다. HF-Smt3 접합체 친화력의 Ni-NTA 비드를 사용하여 정제 하였다. HF-Smt3 (그림 1A와 1B, 왼쪽 패널)없이 제어 변형에 결석했다 스모 기판의 sumoylated 형태의 안티 - 플래그 항체 허용 감지와 정제 HF-Smt3의 웨?...

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Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

연구

생물학

Detection of Protein Ubiquitination

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

효모 세포 Mitochondria의 정화

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...