Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

1. Veksten av gjærceller <ol><li> Inokuler gjærceller i 30 ml YPD (tabell 1) i en liten kolbe. Inkuber ved 30 ° C over natten med risting. </li><li> Fortynn cellene til en optisk tetthet på 0,2 ved 600 nm (OD 600 = 0,2) i 50 ml YPD og inkuber ved 30 ° C med risting. </li><li> Dyrk kulturen til en optisk tetthet på 1,0 ved 600 nm (OD 600 = 1,0). </li><li> Sentrifuger cellene i 5 min ved 2000 xg og kast supernatanten. </li><li> Resuspender cellepelleten i 40 ml sterilt vann o...

<ol>
	<li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-1:+Ubiquitin+gains+weight.">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li><li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4.">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li><li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain.">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li><li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis.">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mub1/Ubr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein.">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).</li><li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast.">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li><li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p.">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li><li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase.">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li><li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation.">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase-promoting+complex/cyclosome+controls+HEC1+stability.">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li><li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIZ1/SIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II.">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li><li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158 (2007).</li><li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li><li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+assembly:+if+you+build+it,+they+will+come.">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li></ol>

EPITOP koder som HA, Myc, flagg, og GST er mye brukt til biokjemisk analyse av proteiner. Bygging av stammer med HF-Smt3 og Myc-merket kinetochore proteiner, slik som Ndc10 og Ndc80, letter påvisningen av PTMs som sumoylation og ubiquitinering. HF-Smt3 trekke ned analysen tillater påvisning av sumoylated kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80 (figur 1). Den affinitetsrensing protokollen og western blot analyse ved hjelp av anti-Flag antistoff etablere spesifisitet av samspillet mellom HF-Smt3 og målpr...

Ubiquitinering og sumoylation tillater konjugering av ubiquitin og små Ubiquitin lignende modifikator (SUMO; Smt3 i S. cerevisiae 1) til et målprotein, respektivt. PTMs av kinetochore proteiner påvirker deres cellulære nivåer og protein-protein interaksjoner i ulike cellesyklusfaser for å sikre trofast kromosom segregering. For eksempel er cellulære nivåer av Cse4 / CENP-A og ytre kinetochore protein Dsn1 regulert av ubiquitin-formidlet proteolyse for å sikre stabilitet genom 2-5. Destabilisering av feil kinetochore-microtubule vedlegg krever Ipl1 / Aurora B kinase som fosforylerer Dam1 og Ndc80 komplekser som direkte samhandler med mikrotubuli 6-8. Til tross for identifisering av over sytti kinetochore proteiner, er det svært få studier som undersøker de modifikasjoner av disse proteinene med PTMs, f.eks ubiquitin og SUMO. En viktig begrensning er evnen til å bevare den PTMs under rensingen og mangelen på tilpassede antistoffer for påvisning av PTMs som sumoylation, fosforylering, metylering, og andre. Karakterisering av sumoylated kinetochore proteiner Ndc10, Cep3, Bir1, og Ndc80 benyttet en tilpasset antistoff 9. I tillegg har Ndc10 vært innblandet som et substrat for ubiquitinering 10. Menneskelig Hec1 (Ndc80 i S. cerevisiae) er også substrat for ubiquitinering, regulert av APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Derfor Ndc10 og Ndc80 er gode kandidater for optimalisering av protokollen for å oppdage både sumoylation og ubiquitinering i S. cerevisiae. For å lette identifiseringen av sumoylation, bygget vi stammer som uttrykker HF-Smt3 og Myc-merket Ndc10 eller Ndc80. Bruken av epitope tags (HF: His6-Flag) minimerer bakgrunnen på grunn av kryssreaksjon som er hyppig observert i polyklonale serum reist mot en kandidat protein. Vi utviklet en protokoll for å affinitetskromatografirense HF-Smt3 konjugater og deretter brukes kommersielle anti-Flag og anti-myc antistoff for å oppdage tilstedeværelsen av sumolyated Ndc10 og Ndc80 i renset Smt3 preparatet. For ubiquitinering, utviklet vi en modifisert immunopresipitering protokoll som bevarer ubiquitinering av Myc-merkede kinetochore proteiner og utført western blot analyse med kommersiell anti-Ub antistoff for å påvise ubiquitinering av Ndc10 og Ndc80.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td align="right">11079105</td>
			<td>0.5 mm dia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini beadbeater</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>#693</td>
			<td>8 cell disrupter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">30430</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7470</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-Myc antibody (A-14)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-789</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-150P</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-258R</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2001</td>
			<td>0.45 mm pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>1.0 mm, 10 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">34078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH7.4</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue sensitive X-Ray film</td>
			<td>Dbio</td>
			<td>DBOF30003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic developer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>M35AX-OMAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2619</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

Post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs), som fosforylering, metylering, acetylering, ubiquitinering, og sumoylation, regulere den cellulære funksjonen til mange proteiner. PTMs av kinetochore proteiner som assosierer med centromeric DNA megle trofast kromosom segregering for å opprettholde genom stabilitet. Biokjemiske metoder som massespektrometri og western blot analyse er mest brukt for identifisering av PTMs. Her blir en proteinrensemetode som er beskrevet som tillater påvisning av både sumoylation og ubiquitinering av kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i Saccharomyces cerevisiae. En stamme som uttrykker polyhistidin-Flag-merket Smt3 (HF-Smt3) og Myc-merket Ndc10 eller Ndc80 ble bygget og brukt til våre studier. For påvisning av sumoylation, utviklet vi en protokoll til affinitetskromatografi rense His-tagget sumoylated proteiner ved hjelp av nikkel perler og brukes western blot analyse med anti-Myc antistoff for å påvise sumoylated Ndc10 ennd Ndc80. For påvisning av ubiquitinering, utviklet vi en protokoll for immunoprecipitation av Myc-merket proteiner og brukes western blot analyse med anti-Ub antistoff for å vise at Ndc10 og Ndc80 er ubiquitinmolekyler. Våre resultater viser at epitop tagget-protein av interesse for Hans-Flag merket Smt3 belastning letter påvisningen av flere PTMs. Fremtidige studier bør tillate utnyttelse av denne teknikken til å identifisere og karakterisere protein interaksjoner som er avhengig av en bestemt PTM.

For å oppdage sumoylation av kinetochore proteiner Ndc80 og Ndc10, stammer med HF-Smt3 og Myc-merket kinetochore proteiner (Ndc80 eller Ndc10) ble konstruert (tabell 2), som tidligere beskrevet 9,12. HF-Smt3 konjugater ble affinitetsrenset bruker Ni-NTA perler. Western blot-analyse av renset HF-Smt3 med et anti-Flag-antistoff tillot påvisning av sumoylated former SUMO substrater som var fraværende i kontrollstammen uten HF-Smt3 (figur 1A og 1B, venstre pan...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Dette manuskriptet beskriver påvisning av sumoylation og ubiquitinering av kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification teknikk som gjør at Påvisning av Sumoylation og ubiquitinering av Spirende gjær kinetochore Proteiner Ndc10 og Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiske Rensing av Highly Active gjær ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Anskaffelse Fluorescens Time-lapse filmer av Spirende gjær og analysere encellede Dynamics bruke grafts

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirende Gjær Protein Extraction og rensing for studier av funksjon, interaksjoner, og posttranslasjonelle modifikasjoner

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...