Name: techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر دايل Hirschkorn من معهد بحوث النظم الدم لمساعدته مع تدفق عداد الكريات ضبط الصك. كان مدعوما من المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل يمنح HL095470 وU01 HL072268 وعقود وزارة الدفاع W81XWH-10-1-0023 وW81XWH-2-0028.

ملاحظة: لقد تم تنفيذ البروتوكولات التالية في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية من أجل رفاهية الإنسان. تم اختبار جميع العينات موضوع الإنسان في إطار مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) البروتوكول وافق عليها وللموافقة المسبقة عن موضوع من الموضوعات. </...

<ol>
	<li>Andaloussi, S., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+platelet-derived+microparticle+formation--and+possible+side+effects-with+prestorage+leukofiltration+of+whole+blood.">Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).</li><li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+Protagonists+of+a+Novel+Communication+Network+for+Intercellular+Information+Exchange.">Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange.</a> Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li><li>Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributing+role+of+extracellular+vesicles+on+vascular+endothelium+haemostatic+balance+in+cancer.">Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Released+by+Melanoma+Cells+Prepare+Sentinel+Lymph+Nodes+for+Tumor+Metastasis.">Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis.</a> Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).</li><li>Gatti, S., Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury.">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li><li>Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microparticles:+square+the+circle.">Circulating microparticles: square the circle.</a> BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).</li><li>Van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+to+understanding+microparticles:+standardized+isolation+and+identification+of+plasma+membrane-derived+vesicles.">Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles.</a> Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).</li><li>Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -. F., L&#243;pez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+microparticles:+Pitfalls+and+protocol+modifications.">Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications.</a> Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).</li><li>Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+microparticles+by+flow+cytometry:+influence+of+centrifugation,+filtration+of+buffer,+and+freezing.">Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing.</a> Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).</li><li>Lacroix, R., Judicone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pre-analytical+variables+in+plasma+microparticle+determination:+results+of+the+International+Society+on+Thrombosis+and+Haemostasis+SSC+Collaborative+workshop.">Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).</li><li>Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogn&#233;, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+issues+in+the+measurement+of+circulating+microparticles:+current+recommendations+and+pending+questions.">Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).</li><li>Peramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Characterization+of+Mouse+Deep+Vein+Thrombosis+Derived+Microparticles+by+Differential+Filtration+with+Nanopore+Filters.">Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters.</a> Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).</li><li>Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Factor+Activity+is+Increased+in+a+Combined+Platelet+and+Microparticle+Sample+from+Cancer+Patients.">Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients.</a> Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).</li><li>Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome.">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).</li><li>Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+and+non-optical+methods+for+detection+and+characterization+of+microparticles+and+exosomes.">Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Miguet, L., Be&#769;chade, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Malignant+B-Cell+Derived+Microparticles+Reveals+CD148+as+a+Potentially+Useful+Antigenic+Biomarker+for+Mantle+Cell+Lymphoma+Diagnosis.">Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).</li><li>Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles.">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li><li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry.">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li><li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles.">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li><li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+(Cell-Derived+Microparticle)+Signatures+in+Joint+Diseases.">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., M&#243;dos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters.">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response:+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling.">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li><li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles:+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it.">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li><li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

وقدمت اثنين من بروتوكولات مختلفة لعزل ومعالجة وتحليل المركبات الكهربائية، وذلك باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. اختيار أنسب طريقة لاستخدام ليست دائما واضحة ويتطلب فهما للعينة التي يجري اختبارها وكذلك مجموعات سكانية فرعية فردية من الفائدة. وعلاوة ...

خارج الخلية الحويصلات (المركبات الكهربائية) هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك بشكل كبير في التواصل خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام التدفق الخلوي (FCM) بالغ الصعوبة نظرا لصغر حجمها وقلة السكان منفصلة إيجابي لعلامات من الفائدة. طرق للتحليل EV، في حين تحسنت تحسنا كبيرا على مدى العقد الماضي، لا يزال التقدم في العمل. لسوء الحظ، ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع البروتوكول، ويجب اعتبار العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. المقدمة هنا عدة تقنيات مختلفة لمعالجة المركبات الكهربائية وبروتوكولين لتحليل المركبات الكهربائية باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. الأساليب المذكورة هنا سوف تساعد في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع بوابات في و عقلانيةashion أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبة لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes. المركبات الكهربائية، المعروف أيضا باسم المجهرية الدقيقة، هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك في الاتصالات خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية 1. من خلال التعبير عن علامات سطح مختلفة و / أو التحويل المباشر للمواد البيولوجية والمركبات الكهربائية قادرة على تغيير وظيفة الخلايا المتلقية للعب إما تفعيل أو قمع الأدوار في التواصل بين الخلايا 2-4. ومن المعروف سريريا، المركبات الكهربائية المستمدة من الصفائح الدموية لديها نشاط مضاد للتخثر قوي 5، في حين تم أظهرت الآخرين للمساهمة في مجموعة واسعة من الشروط، من تعزيز الورم metastaجهاز الأمن والمخابرات 6 إلى حماية ضد مرض 7. ويمكن تصنيف المركبات الكهربائية إلى فئات صغيرة من الحويصلات المشتقة من الخلايا مثل exosomes وmicrovesicles (MVS)، اعتمادا على حجمها وآلية لتوليد 8. تواصل تسمية المجموعات السكانية الفرعية حويصلة المشتقة من خلية ليكون موضوع النقاش الدائر 8،9، ومع ذلك، تم وصفها exosomes عموما صغيرة، 40-100 نانومتر الجزيئات المستمدة من الانصهار endosomal مع غشاء البلازما، في حين MVS تكون أكبر من 100 إلى 1،000 الجسيمات نانومتر التي شكلتها سفك غشاء البلازما 10. هنا، المصطلح العام &quot;السيارات الكهربائية&quot; سوف تستخدم للإشارة إلى جميع أنواع الحويصلات البيولوجية خارج الخلية التي تحررها الخلايا. عزل المركبات الكهربائية من الدم الكامل هو إجراء متعددة الخطوات، وقد أظهرت العديد من المتغيرات معالجة مختلفة للتأثير على المحتوى EV، بما في ذلك درجة حرارة التخزين ومدة 11،12، تخثر / حافظة تستخدم 13 وتستخدم طريقة الطرد المركزي 14. وأدى الحاجة إلى توحيد هذه المتغيرات لتوصيات الجمعية الدولية على تخثر الدم والمعالجة وEV العزلة إجراءات تخثر الدم جنة توحيد القياسي (ISTH SSC) لمناسبة العلمية و15،16، ولكن هناك عدم وجود إجماع بين الباحثين على بروتوكول الأمثل لاستخدام 12. معظم توافق، مع ذلك، أن تخضع لرقابة مشددة متغيرات ما قبل التحليلية حاسمة لبيانات دقيقة وقابلة للتكرار. من أجل تحليل المركبات الكهربائية، واستخدمت الباحثون أساليب مختلفة، بما في ذلك انتقال الإلكترون المجهري 17، المسح الإلكترون المجهري 18،19، مجهر القوة الذرية، وعلى ضوء ديناميكية نثر 20،21 والغربية النشاف 22،23. في حين FCM هو الأسلوب المفضل لكثير من الباحثين 9،24 - 26 نظرا لقدراتها العالية الإنتاجية، وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام FCMمن الصعب المعروف نظرا لحجمها وقلة السكان إيجابي منفصلة 27 - 32. مقارنة تحليل الخلايا، حجم صغير من النتائج المركبات الكهربائية في 1) أقل مضان المنبعثة نتيجة لعدد أقل من المستضدات في الجسيمات و2) الجدوى محدود من الغسيل بعد وصمة عار، وهو أمر ضروري للحد من مضان الخلفية. التحديات المشتركة بين الباحثين وتشمل إشارات الناشئة عن المجاميع المناعي 27،28 والتجميع الذاتي للأجسام 29. وعلاوة على ذلك، أوقات المعالجة طويلة ومطولة إجراءات الغسيل / العزلة التي يستخدمها العديد من البروتوكولات الحالية 33،34 تتطلب التزامات الوقت عدة أيام لتحليل عدد قليل من العينات، مما يجعلها أقل من مثالية لتطبيقات إنتاجية عالية. بعض الباحثين التخلي عن خطوة غسل تماما، مما يجعل المستخدمة تقليديا FCM ضوابط السلبية مثل مضان ناقص واحد (FMO) وisotypes الأجسام المضادة غير مجدية لتقييم بدقة البكالوريامضان kground 30. بروتوكولات عنوان لدينا ثلاث مشاكل المشتركة التي يمكن أن تعوق تحليل FCM السليم من المركبات الكهربائية: إشارات الناشئة عن المجاميع الأجسام المضادة وغيرها من غير الحويصلات، صعوبة في إزالة الأجسام المضادة غير منضم، وعدم وجود السكان إيجابي ملحوظ. سوف التقنيات الموضحة هنا مساعدة في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع البوابات بطريقة عقلانية أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يتم عرض اثنين من طرق الكشف مختلفة هنا: يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبات لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >LSR II benchtop flow cytometer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS Diva software&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >PC version 6.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJo software&#160;</td>
			<td >Treestar US</td>
			<td ></td>
			<td >Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphero Rainbow fluorescent particles</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >556298</td>
			<td >used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra Rainbow fluorescent particles&#160;</td>
			<td >Spherotech</td>
			<td >URFP-10-5</td>
			<td >used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Megmix-Plus SSC beads</td>
			<td >Biocytex</td>
			<td >7803</td>
			<td >used to adjust FSC and SSC&#160; voltages to maintain&#160; consistency&#160; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AbC Anti-Mouse Bead Kit</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-10344</td>
			<td >used for compensation controls &#38; negative AbC beads used for beads-based method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td>
			<td >Santa Cruz&#160;</td>
			<td >sc-281108</td>
			<td >used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD TruCOUNT Tubes</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340334</td>
			<td >used whenver absolute EV concentrations are needed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrafree-MC, GV 0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td >Millipore&#160;</td>
			<td >UFC30GVNB</td>
			<td >used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >364606</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Facs tubes 12x75 polystrene</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >352058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Reservoirs individually wrapped&#160;</td>
			<td >Phenix</td>
			<td >RR-50-1s</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips - 10&#181;L</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L10S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips -200&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L250S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green -Pak pipet tips - 1000&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L1000S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stable Stack L300 tips presterilized</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >SS-L300S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet-Lite&#160;XLS 8 Channel LTS&#160;Adjustable&#160;Spacer&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >LA8-300XLS</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td >E&#38;K Scientific</td>
			<td >EK-20180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Media (without Hepes)</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAE001</td>
			<td >media used for bead-based detection method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2&#181;m filtered</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAL003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td>
			<td >BECKMAN COULTER INC</td>
			<td >344058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL I</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 PerCP-Cy5.5</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >344808</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD14 APC-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301820</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD16 V450</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560474</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >302906</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD152 APC</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555855</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD19 A700</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >302226</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL II</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD41a PerCP-Cy5.5</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340930</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62L APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304810</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD108 PE&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >552830</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD235a FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >349104</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL III</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD11b PE-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301322</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62p APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304910</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD66b PE&#160;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >305106</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD15 FITC</td>
			<td >exalpha</td>
			<td >X1496M</td>
			<td >5 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD9 PE</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >555372</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD63 APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >353008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC-Cy7 Ms IgG2a, &#954;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >400230</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

خارج الخلية الحويصلات (المركبات الكهربائية) هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك بشكل كبير في التواصل خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام التدفق الخلوي (FCM) بالغ الصعوبة نظرا لصغر حجمها وقلة السكان منفصلة إيجابي لعلامات من الفائدة. طرق للتحليل EV، في حين تحسنت تحسنا كبيرا على مدى العقد الماضي، لا يزال التقدم في العمل. لسوء الحظ، ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع البروتوكول، ويجب اعتبار العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. المقدمة هنا عدة تقنيات مختلفة لمعالجة المركبات الكهربائية وبروتوكولين لتحليل المركبات الكهربائية باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. الأساليب المذكورة هنا سوف تساعد في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع بوابات في و عقلانيةashion أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبة لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes.

<html> ويبين الشكل 1 الخطة الشاملة لعزل وكشف عن المركبات الكهربائية باستخدام إما طريقة القائم على حبة أو طريقة الكشف الفردية المعالجة. كشف الفردية من المركبات الكهربائية باستخدام FCM يعمل بشكل جيد لتحليل المركبات الكهربائية الكبيرة إلا أن معظم cytometers ليست قادرة ...

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry at JoVE.com

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

وجود العديد من الطرق المختلفة لقياس الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) باستخدام التدفق الخلوي (FCM). وينبغي النظر في العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. يتم عرض بروتوكولين لقياس المركبات الكهربائية، وذلك باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة.

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

تتبع الزمني للتقدم دورة الخلية باستخدام التدفق الخلوي دون الحاجة إلى مزامنة

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LED Thermo Flow ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LED الحرارية تدفق - الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

توصيف البروتين عبر الغشاء الحويصلة خارج الخلية بواسطة قياس التدفق الخلوي النانوي

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...