Name: zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing
Uploaded: 2015-02-25T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra Midwestern University College of Health Sciences Research Lettelse Grant tildeles EEH og Midwestern University Office of Research og sponsoreret udsendelse Intramural Grant tildeles KJL.

Denne protokol er i overensstemmelse med AVMA dyrevelfærdsprincipper for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Midwestern University. 1. Fremstilling af anæstesi, Udstyr, og medier <ol><li> Dechlorinate ca. 1,5 L postevand ved hjælp af enten et kommercielt dechlorinating agent (findes på dyrehandlere) eller ved at lade vand stå i 24 timer. Opnå tre 1 L bægerglas og fylde hver med 500 ml dechlorerede vand. M...

<ol>
	<li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases.">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li><li>Lacayo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+large-scale+cell+morphology+and+movement+from+local+actin+filament+growth+dynamics.">Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics.</a> PLOS Biology. 5, 233 (2007).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+locomotion+for+simple-shaped+cells.">Principles of locomotion for simple-shaped cells.</a> Nature. 362, 167-171 (1993).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Movement+of+Cell+Clusters.">The Movement of Cell Clusters.</a> J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+tension+on+protrusive+activity+and+microfilament+and+intermediate+filament+organization+in+an+epidermal+epithelium+moving+in+culture.">Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture.</a> The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+of+primary+zebrafish+keratocytes.">Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes.</a> Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Zebrafish+as+a+Model+System+for+Cutaneous+Wound-Healing+Research.">Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+pro-inflammatory+cytokines+and+metalloproteinase-1+by+TGF-b1+in+synovial+fibroblasts+from+rheumatoid+arthritis+and+normal+individuals.">Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals.</a> Clinica., &amp; Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).</li><li>Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+MMP-2+expression+and+secretion+change+with+increasing+serial+passage+of+keratocytes+in+culture.">Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).</li><li>Schnaper, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+extracellular+matrix+proteins+and+decreased+expression+of+matrix+proteases+after+serial+passage+of+glomerular+mesangial+cells.">Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells.</a> Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).</li><li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+matrix+metalloproteinase/tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+production+by+mesenchymal+stromal+cells+in+response+to+inflammatory+cytokines:+the+role+of+their+migration+in+injured+tissues.">In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues.</a> Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).</li><li>Zimmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts+from+primary+culture+-+primary+culture+cells+markedly+differ+from+fourth-passage+cells.">Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells.</a> Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system:+differential+gene+expressio.,+&amp;+morphological+changes+support+epithelial&#8211;mesenchymal+transition.">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., &amp; morphological changes support epithelial&#8211;mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li><li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+(transforming+growth+factor+b)+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures.">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li><li>Barut, B. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+zebrafish+as+a+model+for+human+disease.">Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease.</a> Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).</li><li>Yen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+heterogeneity+and+mutational+burden+of+engineered+melanomas+in+zebrafish+models.">The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models.</a> Genome Biology. 14, R113 (2013).</li><li>Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+and+Sdf-1+Pathways+Interact+during+Zebrafish+Fin+Regeneration.">Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration.</a> PLoS One. 4, e5824 (2009).</li><li>Dufourcq, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1+regulates+blastema+formation+during+zebrafish+fin+regeneration.">The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin.">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).</li><li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides.">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).</li><li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Morpholino+Approach+Using+Cardiac+Ventricular+Injection+to+Transfect+Multiple+Difficult-to-target+Tissues+in+the+Zebrafish+Larva.">Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).</li><li>Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expression+of+transgenes+in+adult+zebrafish+by+electroporation.">Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation.</a> BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+collective+migration,+leader+keratocytes+generate+tension+in+sheet+and+may+become+follower+or+individually+migrating+cells.">During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells.</a> Experimental Cell Research. In press, (2014).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models).">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models).</a> The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures:+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation.">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li><li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+zebrafish,+Danio+rerio+(cyprinidae),+using+scale+regeneration.">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+skin,+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses.">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

Det mest kritiske skridt for succes keratocyte eksplantation kultur tillader skalaen til at holde sig til kultur skål for ca. 2 - 3 min før tilsætning af dyrkningsmediet. Ca. 75% af skalaer vil klæbe og vokse ark (antallet af kulturer, der er etableret for hvert forsøg skal justeres i overensstemmelse hermed). Keratocyte ark ikke danner omkring hver skala fjernes fra fisken og anbragt i kultur i flere grunde. Først DAPI farvning af eksplantater viser, at visse skalaer har få celler fæstnet, og dermed forventes d...

<html> Undersøgelser af cellemotilitet har traditionelt fokuseret på individuelt migrerende celler. Keratocytter dyrket fra fisk og padder eksplantater har vist sig at være et effektivt modelsystem til at studere mekanismerne i cellemotilitet hjælp af både eksperimenterende og matematisk modellering 1-6. Eksperimentelt arbejde individuelt migrerende celler er hjulpet af den hurtige, glatte glidende bevægelse af cellerne, og samtidig opretholde en ensartet form, hastighed og retning. Men in vivo celler ofte flytte kollektivt samtidig opretholde celle-celle-kryds, især under embryogenese, sårheling og metastase. Således kollektiv celle migration er et voksende og stadig mere fremtrædende forskningsområde inden for celle migration. Den kollektive migration af disse celler er for nylig blevet beskrevet 7 og det har mange unikke egenskaber, som gør det et kraftfuldt system til at studere kollektivt cellemigration i sårheling model. ove_content &quot;&gt; Når skalaer er plukket fra en bedøvet voksen zebrafisk, forbliver nogle epitelvæv fastgjort til undersiden af ​​skalaen. Når der tilføjes cellekulturmedium, disse epitelceller eller keratocytter, migrere hurtigt som en kollektiv enhed fra skalaen. Den eksplantation kultur kan ses som en epitelial sårheling model, hvor cellerne migrerer væk fra eksplantatet, som de ville tværs midlertidig matrix af en sårbunden at genetablere et intakt epitel. Nylige data tyder på, at denne ex vivo kultur efterligner mange funktioner i in vivo sårheling hos voksne zebrafisk. sårlukning satser 8 oversætte til en migration hastighed svarende til den observeret i ex vivo-systemet 7. Endvidere i en in vivo sårheling model, behandling med warfarin antyder, at hæmostase har nogen effekt på pris for helbredelse, mens behandling med hydrocortison at mindske immunrespons ikke forsinker reepitelisering 8 </sup&gt;. Da zebrafisk ikke bløder, når skalaen er fjernet fra dyret, hæmostase er ikke en vigtig aktør. Selvom vi har fundet immunceller i eksplantater, har vi ikke undersøgt de virkninger, de måtte have på kollektiv celle migration. Protokollen præsenteres her beskriver, hvordan man etablerer zebrafisk keratocyte eksplantatkulturer der sikrer ensartethed og reproducerbarhed til brug i mange biologiske assays. Disse eksplantatkulturer er en særlig overbevisende in vitro model for kollektiv cellemigration af flere grunde. Først zebrafisk keratocytter er primære celler, der anvendes inden for timer efter oprettelse eksplantatkulturer. Derfor har disse celler ikke har undergået de morfologiske og genekspression ændringer i forbindelse med passage af primærelementer 9-13. For det andet udgør denne ordning en model for studiet af reepitelisering som reaktion på såret 14 og som en del af svaret på såret, en epitelial til mesenkymale transition (EMT) proces initieres som vist ved ændringer i genekspression og cytoskeletale omlejringer 14,15. Således har baggrunden ændringer i genekspression og motilitet, som forekommer i ubehandlede celler er blevet karakteriseret, og giver en forbindelse til at fortolke ændringer med behandling. Endvidere fisk keratocyte og den humane keratinocyt er funktionelt ækvivalente; begge er de primære epitelceller fra deres respektive arter og spiller en central rolle i epitel sårheling. Tredje voksen zebrafisk vinder anerkendelse som et modelsystem til en række humane sygdomme 16-18 herunder melanom og andre cancere 19-21, kutan sårheling 8,14 og vævsregenerering 22-24. Tekniske fordele ved dette modelsystem er lige overbevisende. Et stigende antal mutante og transgene linjer er tilgængelige fra non-profit, centraliserede anlæg. Specifikt zebrafisk Mutation Project (ZMP) På Wellcome Trust Sanger Institute har til formål at skabe en knockout allel i hvert proteinkodende gen i zebrafisk genom. I øjeblikket har de muterede 11.892 gener, ca. 45% af genomet, med 24.088 alleler karakteriseret. Desuden ZMP accepterer forslag, og vil generere gratis knock-outs. Nylige metoder i gen knockdown i larver og voksne zebrafisk 25-28 giver fleksibilitet til at studere funktionen af udviklingsmæssigt vigtige gener for hvilke transgene metoder er problematiske eller upraktisk. På grund af deres ekstremt hurtige satser for motilitet ~ 145 um / time kort efter etablering af kulturer 29, kan analyser afsluttes hurtigt (normalt i 24 timer eller mindre). Som forsøg kan gennemføres hurtigt og kulturer vokser godt ved stuetemperatur, flere af de tekniske forhindringer, der er forbundet med mammale celle migration assays involverer video mikroskopi undgås. Desuden i en alder af stramme forskningsbudgetter, zebrafish er nemt og billigt vedligeholdt. Strukturen og adfærd eksplantatet er kompleks. Da fisken ikke bløder, når skalaen er fjernet, er det usandsynligt, at meget mere end de overfladiske epidermale lag fjernes med skalaen. Keratocytter synes at være den dominerende celletype i eksplantatet når skalaer indledningsvis fjernes fra fisk som størstedelen af cellerne synes at pletten med et anti-E-cadherin antistof 14. Endvidere er der ingen tegn på fibroblaster i den oprindelige kultur, bedømt ved fraværet af vimentin farvning ved immunofluorescens 14. Men med fjernelse gentagen skala, synes der at være mange neutrofiler i eksplantatet (se Video 1). Vi har identificeret disse celler som neutrofiler baseret på morfologiske observationer af deres størrelse, hurtigt motilitet, og deres vandring ud af cellen arket, når de udsættes for LPS (data ikke vist). Derudover disse celler farves lyst with et antistof mod neutrofil cytosol faktor såvel som med en række sekundære IgG-antistoffer, hvilket indikerer, at de har rigelige FcR&#39;er på deres overflade (data ikke vist). Flere cellelag er til stede i eksplantatet. Konfokal mikroskopi afslører tilstedeværelsen af ​​et enkelt lag nær forkanten til mere end to lag keratocytter nær skala med neutrofiler synlige over, under og mellem celle keratocyte ark. Ved tidlige tidspunkter, celler på kanten af ​​flere lag explant polarisere, indlede kollektive migration af keratocytter fra eksplantatet ved indledende satser ~ 145 um / time. Det område, som eksplantatet stiger hurtigt, hvilket fører til celle spredning, spænding i pladen, og en nedsat hastighed af forud for forkanten. Hurtige interomdannelser mellem leder og follower celler observeres på forkant under dannelsen og lukning af spontant dannede huller i arket 7. SomEMT indledt med eksplantatet fortsætter arket fragmenter og de keratocytter mister deres specialiserede, hurtige motilitet. Genekspression og morfologiske ændringer i overensstemmelse med EMT, sårheling, og inflammatoriske reaktioner forekommer inden for 7 dages dyrkning med eksplantater overvejes rentabelt for ca. 10 dage 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

På grund af deres unikke bevægelige egenskaber, fisk keratocytter adskilles fra eksplantatkulturer længe har været anvendt til at undersøge mekanismerne for enkelt celle migration. Men når eksplantater er etableret, disse celler også flytte kollektivt, vedligeholdelse mange af de funktioner, der gør individet keratocytter en attraktiv model til at studere migration: hurtige satser af motilitet, omfattende actin-rige lameller med en vinkelret actin kabel og relativt konstant hastighed og retning af migration. I begyndelsen af ​​eksplantater, den hurtige omdannelse af celler migrerer individuelt med de migrerer kollektivt tillader studiet af den rolle, celle-celle sammenvoksninger at bestemme tilstanden af ​​migration, og understreger de molekylære forbindelser mellem de to former for migration. Celler i senere eksplantater mister deres evne til at migrere hurtigt og kollektivt som en epitelial til mesenkymale overgang forekommer, og gener, der er forbundet med sårheling og inflammation udtrykkes forskelligt. Således kan keratocyte eksplantater tjene som en in vitro model for reepitelisering, der opstår under kutan sårheling og kan repræsentere et unikt system til at studere mekanismer for kollektive cellemigrering i forbindelse med en defineret program af genekspression ændringer. En række af mutante og transgene zebrafisk linjer er tilgængelige, som giver eksplantater oprettes fra fisk med forskellige genetiske baggrunde. Dette tillader rolle af forskellige proteiner i disse processer til entydigt rettet. Protokollerne beskrevet her beskriver en nem og effektiv fremgangsmåde til etablering af disse eksplantatkulturer til anvendelse i en række assays relateret til kollektiv cellemigrering.

Som illustreret i figur 1, kan ark keratocytter observeres migrere ud fra under skala i timer oprettelse eksplantatet kultur. Indimellem kan en individuelt migrerende keratocyte der har brudt væk fra kollektivt migrere ark overholdes. Desuden, som eksplantatet blev etableret fra en fisk, der tidligere var blevet plukket, der er rigelige neutrofiler, der migrerer gennem arket. På længere kultur perioder de keratocyte ark fragmenter som celler undergår EMT 14. D...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebrafisk keratocytter migrere i celle plader fra eksplantater og give en in vitro model for studiet af mekanismerne i kollektiv celle migration i forbindelse med epitelial sårheling. Disse protokoller detalje en effektiv måde at etablere primære eksplantatkulturer til brug i kollektive celle migration assays.

Zebrafisk Keratocyte Eksplantater at studere Kollektiv Cell Migration og reepitelisering i kutant Sårheling

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Vurdering af endotelcellemigration Efter eksponering for giftige kemikalier

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimering af såret Scratch-analysen til at påvise ændringer i murine Mesenchymale stromacelle Migration efter skade ved Opløselig Cigaret røgekstrakt

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stamcelle-lignende<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Eksplantater at studere Tidlig Neural Udviklingsmæssige Egenskaber<em&gt; In vitro</em&gt; Og<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Migration hjælp Cell transplantationer og Time-lapse Imaging i zebrafisk embryoner

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Metoder til at studere Mrp4-holdige Makromolekylær Komplekser i forordningen af ​​fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Udvikling af en Ethanol-induceret Fibrotiske Lever Model i Zebrafisk at studere progenitorcelle-medieret hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Adenoviral Genterapi for Diabetic keratopati: Virkninger på sårheling og Stem Cell Marker Expression i Human Organ-dyrkede hornhinder og limbal epitelceller

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Culture of Adult transgene zebrafisk Retinal Eksplantater til Live-celle Imaging af multifoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

En indretning til udførelse Cell Migration / Wound Healing i en plade med 96 brønde

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...