Name: zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing
Uploaded: 2015-02-25T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמערב התיכונה אוניברסיטת קולג &#39;למדעי בריאות מחקר הנחיית גרנט זכה לEEH ומשרד אוניברסיטת המערב התיכון של מחקר ותוכניות ממומנים ביצוע העצמי גרנט זכה לKJL.

פרוטוקול זה תואם את עקרונות הרווחה AVMA בעלי החיים לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה ואושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה במערב התיכון. 1. הכנת ההרדמה, הציוד, ומדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:righ...

<ol>
	<li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases.">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li><li>Lacayo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+large-scale+cell+morphology+and+movement+from+local+actin+filament+growth+dynamics.">Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics.</a> PLOS Biology. 5, 233 (2007).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+locomotion+for+simple-shaped+cells.">Principles of locomotion for simple-shaped cells.</a> Nature. 362, 167-171 (1993).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Movement+of+Cell+Clusters.">The Movement of Cell Clusters.</a> J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+tension+on+protrusive+activity+and+microfilament+and+intermediate+filament+organization+in+an+epidermal+epithelium+moving+in+culture.">Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture.</a> The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+of+primary+zebrafish+keratocytes.">Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes.</a> Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Zebrafish+as+a+Model+System+for+Cutaneous+Wound-Healing+Research.">Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+pro-inflammatory+cytokines+and+metalloproteinase-1+by+TGF-b1+in+synovial+fibroblasts+from+rheumatoid+arthritis+and+normal+individuals.">Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals.</a> Clinica., &amp; Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).</li><li>Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+MMP-2+expression+and+secretion+change+with+increasing+serial+passage+of+keratocytes+in+culture.">Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).</li><li>Schnaper, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+extracellular+matrix+proteins+and+decreased+expression+of+matrix+proteases+after+serial+passage+of+glomerular+mesangial+cells.">Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells.</a> Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).</li><li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+matrix+metalloproteinase/tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+production+by+mesenchymal+stromal+cells+in+response+to+inflammatory+cytokines:+the+role+of+their+migration+in+injured+tissues.">In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues.</a> Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).</li><li>Zimmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts+from+primary+culture+-+primary+culture+cells+markedly+differ+from+fourth-passage+cells.">Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells.</a> Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system:+differential+gene+expressio.,+&amp;+morphological+changes+support+epithelial&#8211;mesenchymal+transition.">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., &amp; morphological changes support epithelial&#8211;mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li><li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+(transforming+growth+factor+b)+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures.">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li><li>Barut, B. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+zebrafish+as+a+model+for+human+disease.">Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease.</a> Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).</li><li>Yen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+heterogeneity+and+mutational+burden+of+engineered+melanomas+in+zebrafish+models.">The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models.</a> Genome Biology. 14, R113 (2013).</li><li>Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+and+Sdf-1+Pathways+Interact+during+Zebrafish+Fin+Regeneration.">Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration.</a> PLoS One. 4, e5824 (2009).</li><li>Dufourcq, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1+regulates+blastema+formation+during+zebrafish+fin+regeneration.">The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin.">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).</li><li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides.">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).</li><li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Morpholino+Approach+Using+Cardiac+Ventricular+Injection+to+Transfect+Multiple+Difficult-to-target+Tissues+in+the+Zebrafish+Larva.">Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).</li><li>Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expression+of+transgenes+in+adult+zebrafish+by+electroporation.">Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation.</a> BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+collective+migration,+leader+keratocytes+generate+tension+in+sheet+and+may+become+follower+or+individually+migrating+cells.">During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells.</a> Experimental Cell Research. In press, (2014).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models).">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models).</a> The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures:+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation.">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li><li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+zebrafish,+Danio+rerio+(cyprinidae),+using+scale+regeneration.">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+skin,+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses.">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

השלב הקריטי ביותר להצלחה של תרבות explant keratocyte מאפשר קנה המידה לדבוק בתרבות הצלחת כ 2-3 דקות לפני תוספת של מדיום התרבות. כ -75% מקשקשים ידבק ולגדול גיליונות (מספר התרבויות שנקבעו לגבי כל ניסוי צריך להיות מותאם בהתאם). גיליונות Keratocyte לא יוצרים סביב כל קנה מידה הוסרה מהדגים ו?...

<html> מחקרים של תנועתיות תא התמקדו בעיקר בתאים בנפרד נודדים. Keratocytes תרבית מדגים ודו-חי explants הוכיח להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי לחקור את המנגנונים של תנועתיות תא באמצעות מודלים מתמטיים והן ניסיוניים גישות 1-6. עבודה ניסויית בתאים בנפרד נודדים נעזר בתנועה המהירה, חלקת הגלישה של התאים, תוך שמירה על צורה, מהירות, וכיוון אחיד. עם זאת, in vivo, תאים לעתים קרובות לעבור באופן קולקטיבי, תוך שמירה על צמתים תא-תא, במיוחד בעובר, ריפוי פצעים, וגרורות. לפיכך, נדידת תאים קולקטיבית הוא אזור גידול והבולט יותר ויותר של מחקר בתחום של נדידת תאים. לאחרונה ההגירה הקולקטיבית של תאים אלה תוארה 7 ויש לו תכונות ייחודיות רבות ההופכות אותו למערכת רבת עוצמה כדי לחקור נדידת תאים קולקטיבית במודל ריפוי פצע. &quot;&gt; כאשר מאזניים קטפו מדג זברה מבוגרת בהרדמה, כמה רקמות אפיתל נשארה מחוברת לחלק התחתון של הסולם. כאשר מדיום תרבית תאים הוא הוסיף, תאי האפיתל אלה, או keratocytes ove_content, להעביר במהירות כיחידה קולקטיבית מהסולם. ניתן לצפות בתרבות explant כמודל ריפוי פצע אפיתל, שבו התאים לנדוד הרחק מexplant כפי שהם היו על פני המטריצה ​​הזמנית של פצע המיטה כדי לבסס מחדש את האפיתל ללא פגע. נתונים אחרונים מצביעים על כך שvivo לשעבר זה מחקה תרבות תכונות רבות של in vivo ריפוי הפצע בדג זברה מבוגרת. שיעורי סגירת פצעים 8 לתרגם למהירות הגירה דומה לזה שנצפה במערכת vivo לשעבר 7. בנוסף, בפצע in vivo ריפוי מודל, הטיפול בקומדין מצביע על כך שיש עצירה דימום אין כל השפעה על שיעור של ריפוי, בעוד שהטיפול בהידרוקורטיזון כדי להקטין את התגובה חיסונית לא לעכב reepithelialization 8 </sup&gt;. כדג הזברה אינה לדמם כאשר קנה המידה היא להסיר את בעלי החיים, עצירת דימום הוא לא שחקן מרכזי. למרות שמצאנו תאים חיסוניים בexplants, יש לנו לא בחנו את ההשפעות שאולי יש להם בנדידת תאים קולקטיבית. הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד להקים תרבויות explant keratocyte דג הזברה שלהבטיח עקביות ושחזור לשימוש במבחנים רבים ביולוגיים. תרבויות explant אלה הן משכנעים במיוחד במודל חוץ גופית לנדידת תאים קולקטיבית מכמה סיבות. ראשית, keratocytes דג הזברה הם תאים ראשוניים בשימוש בתוך שעות של הקמת תרבויות explant. לכן, תאים אלה לא עברו שינויים מורפולוגיים וביטוי גנים הקשורים למעבר של תאים ראשוניים 9-13. שנית, מערכת זו מהווה מודל לחקר reepithelialization בתגובה לפציעתם 14 ו, כחלק מהתגובה לפציעה, אפיתל לtr mesenchymalansition תהליך (EMT) הוא יזם כפי שמעיד שינויים בביטוי הגנים וארגון מחדש cytoskeletal 14,15. לפיכך, השינויים בביטוי הגנים הרקע ותנועתיות המתרחשים בתאים שלא טופלו כבר מאופיינים ולספק הקשר לפרש שינויים בטיפול. יתר על כן, keratocyte הדגים וkeratinocyte האנושית הן תפקודיות שווי ערך; שניהם תאי האפיתל העיקריים של מיניהם ולשחק תפקיד מפתח בריפוי פצע אפיתל. דג הזברה שלישית, מבוגר זוכה להכרה כמערכת מודל עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם 16-18 כוללים מלנומה וסוגי סרטן אחרים 19-21, פצע cutaneous ריפוי 8,14 ורקמות התחדשות 22-24. יתרונות טכניים של מערכת מודל זה הם פחות משכנעים. מספר הולך וגדל של קווים מוטנטים ומהונדסים זמינים ללא כוונת רווח, מתקנים מרכזיים. באופן ספציפי, דג הזברה מוטצית הפרויקט (ZMP) בWellcome Trust סנגר המכון שואף ליצור אלל נוקאאוט בכל חלבון קידוד גנטי בגנום דג הזברה. נכון לעכשיו, יש להם מוטציה 11,892 גנים, כ -45% מהגנום, עם 24088 אללים מאופיינים. בנוסף, ZMP מקבל הצעות ויפיק לדפוק outs ללא תשלום. השיטות האחרונות במציאת גן בדג זברה זחל והמבוגר 25-28 לספק גמישות ללמוד את הפונקציה של גנים חשובים מבחינה התפתחותית שלגישות מהונדסים הן בעייתיות או לא מעשיות. בשלהם שיעורים מאוד מהירים של תנועתיות ~ 145 מיקרומטר / hr זמן קצר לאחר הקמתה של תרבויות 29, ניתן להשלים במהירות מבחני (בדרך כלל 24 שעות באו פחות). כפי שניתן הושלמו ניסויים במהירות ובתרבויות לגדול גם ב RT, כמה מהמכשולים הטכניים הקשורים למבחני נדידת תאי יונקים מעורבים מיקרוסקופיה וידאו נמנעים. בנוסף, בגיל של הידוק תקציבי מחקר, zebrafish נשמרים בקלות ובזול. המבנה וההתנהגות של explant הוא מורכב. כדגים לא לדמם כאשר קנה המידה מוסר, אין זה סביר כי הרבה יותר משכבות אפידרמיס השטחיות יוסרו עם הסולם. Keratocytes נראה סוג התא הדומיננטי בexplant כאשר קשקשים לראשונה הוסרו מהדגים כמו הרוב המכריע של תאים מופיעים להכתים עם נוגדן אנטי E-cadherin 14. יתר על כן, אין ראיות של fibroblasts בתרבות הראשונית כמו להישפט על ידי העדר כתמי vimentin על ידי immunofluorescence 14. עם זאת, עם הסרת קנה מידה חוזרת ונשנית, נראה שיש מספר רב של נויטרופילים בexplant (ראה וידאו 1). אנו זיהינו תאים אלה כנויטרופילים המבוססים על תצפיות מורפולוגיים לגודל שלהם, במהירות תנועתיות, והגירתם אל מחוץ לגיליון התא בעת החשיפה לLPS (מידע לא מוצג). בנוסף, תאים אלה כתם בהיר שנינותh נוגדנים לגורם cytosolic נויטרופילים, כמו גם עם מגוון רחב של נוגדני IgG משניים, אשר מציין כי יש להם בשפע FcRs על פני השטח שלהם (מידע לא מוצגים). שכבות תאים מרובות נמצאות בתוך explant. מיקרוסקופיה Confocal חושפת את הנוכחות של שכבה אחת ליד הקצה המוביל ליותר משתי שכבות של keratocytes ליד קנה המידה עם נויטרופילים נראים מעל, מתחת, ובין סדיני keratocyte התא. בנקודות זמן מוקדמות, תאים בקצה לקטב explant הרב שכבתי, ייזום הגירה קולקטיבית של keratocytes מexplant בשיעורים ראשוניים של ~ 145 מיקרומטר / hr. האזור המכוסה על ידי explant מגדיל במהירות, מה שמוביל לתא התפשטות, מתח בתוך גיליון, ושיעור ירידה במראש של הקצה קדמי. interconversions המהיר בין תאי מנהיג וחסיד הם נצפו בקצה המוביל במהלך ההיווצרות וסגירת חורים שנוצרו באופן ספונטני בתוך גיליון 7. כתהליך EMT יזם עם explant ממשיך, הברים וכו &#39;וkeratocytes לאבד תנועתיות מיוחדת, המהירה. ביטוי גנים ושינויים מורפולוגיים בקנה אחד עם EMT, ריפוי פצעים, ותגובות דלקתיות להתרחש תוך 7 ימים של תרבות עם explants נשקלים קיימא עבור כ 10 ימים 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

בשל המאפיינים הייחודיים שלהם ניע, keratocytes הדגים ניתק מתרבויות explant כבר מזמן משמשות כדי לחקור את המנגנונים של נדידת תאים בודדת. עם זאת, כאשר explants הוקם, תאים אלה גם לנוע באופן קולקטיבי, שמירה רב של התכונות ההופכות את פרט keratocytes מודל אטרקטיבי ללמוד הגירה: שיעורים מהירים של תנועתיות, lamellae אקטין עשיר נרחב עם כבל אקטין בניצב, ומהירות קבועה יחסית ו כיוון ההגירה. בexplants המוקדם, הדדי המהירה של תאים נודדים באופן אישי עם אלה נודדים באופן קולקטיבי מאפשר הלימוד של התפקיד של הידבקויות תאי תאים בקביעת המצב של הגירה, ומדגיש את הקישורים המולקולריים בין שני המצבים של הגירה. תאים בexplants מאוחר יותר לאבד את היכולת שלהם לנוע במהירות ובאופן קולקטיבי כאפיתל מעבר mesenchymal מתרחש וגנים הקשורים לריפוי פצעים ודלקת באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. לפיכך, explants keratocyte יכול לשמש כמודל במבחנה לreepithelialization המתרחש במהלך ריפוי פצע עורי ויכול לייצג את מערכת ייחודית ללמוד מנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של תכנית מוגדרת של שינויי ביטוי גנים. מגוון רחב של קווי דג הזברה מוטציה ומהונדסים זמין, המאפשר explants שיוקם מדגים עם רקע גנטי שונה. זה מאפשר את התפקיד של חלבונים שונים בתוך תהליכים אלה יש לטפל באופן ייחודי. הפרוטוקולים המפורטים כאן מתארים שיטה קלה ויעילה להקמת תרבויות explant אלה לשימוש במגוון רחב של מבחני הקשורים לנדידת תאים קולקטיבית.

כפי שמודגם באיור 1, גיליונות של keratocytes ניתן לצפות נודדים החוצה מתחת לקנה המידה בתוך שעות של הקמת תרבות explant. מדי פעם, יכול להיות שנצפה keratocyte בנפרד נודדת שהתנתק מהגיליון הנודד באופן קולקטיבי. בנוסף, כexplant הוקם מדגים שנתלשו בעבר, יש בשפע נויטרופילים הנודדים דרך ג...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.

Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

תרפיה adenoviral ג&#39;ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...