Name: zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing
Uploaded: 2015-02-25T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi Midwestern University College of Health Sciences Research facilitazione sovvenzione concessa a EEH e Midwestern University Ufficio di Ricerca e Programmi sponsorizzati intramurale sovvenzione concessa a KJL.

Questo protocollo è conforme al benessere Principi AVMA animali per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dalla cura e l&#39;uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) a Midwestern University. 1. Preparazione di Anestesia, attrezzature, &amp; Media <ol><li> Declorurare circa 1,5 L di acqua di rubinetto per mezzo di un agente commerciale declorante (disponibile nei negozi di animali da compagnia) o il ristagno d&#39;acqua per 24 ore. Ottenere tre bicchieri 1 L ...

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	<li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases.">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li><li>Lacayo, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system:+differential+gene+expressio.,+&amp;+morphological+changes+support+epithelial&#8211;mesenchymal+transition.">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., &amp; morphological changes support epithelial&#8211;mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li><li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+(transforming+growth+factor+b)+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures.">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li><li>Barut, B. 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R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin.">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).</li><li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides.">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).</li><li>Konantz, J., Antos, C. 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La fase più critica per il successo della cultura keratocyte espianto sta permettendo la scala di aderire al piatto di coltura per circa 2 - 3 minuti prima dell&#39;aggiunta del terreno di coltura. Circa il 75% di scale aderire e crescere fogli (il numero di culture stabiliti per ogni esperimento dovrà essere adeguato di conseguenza). Fogli Keratocyte non formano intorno ad ogni scala rimosso dal pesce e messo in coltura per diversi motivi. In primo luogo, DAPI colorazione di espianti rivela che alcune scale hanno poc...

<html> Studi di motilità cellulare si sono tradizionalmente concentrati sulle cellule migrano individualmente. Cheratociti coltivate dai pesci e anfibi espianti hanno dimostrato di essere un sistema potente modello per studiare i meccanismi di motilità cellulare utilizzando la modellazione sia sperimentale e matematica approcci 1-6. Il lavoro sperimentale sulle cellule migrano singolarmente è aiutata dal rapido movimento scorrevolezza delle cellule, mantenendo uniforme forma, velocità e direzione. Tuttavia, in vivo, le cellule si muovono spesso insieme pur mantenendo giunzioni cellula-cellula, in particolare durante l&#39;embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi. Così, la migrazione cellulare collettiva è un settore in crescita e sempre più importante della ricerca nel campo della migrazione delle cellule. La migrazione collettiva di queste cellule è stata recentemente descritta 7 ed ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente sistema per studiare la migrazione delle cellule collettiva in un modello di guarigione delle ferite. ove_content &quot;&gt; Quando le scale vengono pizzicate da un zebrafish adulto anestetizzato, alcuni tessuti epiteliali rimane attaccato alla parte inferiore della scala. Quando si aggiunge mezzo di coltura cellulare, queste cellule epiteliali, o cheratociti, migrano rapidamente come unità collettiva dalla scala. Il Espianto può essere visto come un modello di guarigione delle ferite epiteliale, in cui le cellule migrano dalla espianto come farebbero nella matrice provvisoria del letto della ferita per ristabilire un epitelio intatto. Dati recenti suggeriscono che questa coltura ex vivo imita molte caratteristiche di in vivo la guarigione delle ferite in zebrafish adulto. tassi chiusura della ferita 8 si traducono in una velocità di migrazione simile a quello osservato nella ex vivo sistema 7. Inoltre, in una ferita in vivo guarigione del modello, il trattamento con warfarin suggerisce che l&#39;emostasi non ha alcun effetto sul tasso di di guarigione, mentre il trattamento con idrocortisone per diminuire la risposta immunitaria non ritardare riepitelizzazione 8 </sup&gt;. Come il pesce zebra non sanguina quando la bilancia è rimosso dall&#39;animale, emostasi non è un giocatore importante. Anche se abbiamo trovato cellule immunitarie in espianti, non abbiamo studiato gli effetti che potrebbero avere sulla migrazione cellulare collettiva. Il protocollo presentato qui descritto come stabilire le culture zebrafish keratocyte espianto a garantire la coerenza e riproducibilità per l&#39;uso in molti saggi biologici. Queste culture espianto sono particolarmente convincenti modello in vitro per la migrazione delle cellule collettivo per diversi motivi. In primo luogo, cheratociti zebrafish sono pile utilizzate entro ore di stabilire culture espianto. Pertanto, queste cellule non hanno subito i cambiamenti morfologici e espressione genica associati con passaggio di cellule primarie 9-13. In secondo luogo, questo sistema rappresenta un modello per lo studio di riepitelizzazione in risposta al ferimento 14 e, come parte della risposta al ferimento, un epiteliale al mesenchimale transition processo (EMT) è iniziata come evidenziato da cambiamenti nell&#39;espressione genica e riarrangiamenti del citoscheletro 14,15. Così, lo sfondo cambiamenti nell&#39;espressione genica e motilità che si verificano in cellule non trattate sono stati caratterizzati e fornire un contesto per interpretare modifiche con trattamento. Inoltre, il pesce e la keratocyte cheratinociti umani sono funzionalmente equivalenti; entrambi sono le cellule epiteliali primarie dei rispettivi specie e svolgono un ruolo chiave nella epiteliale guarigione della ferita. In terzo luogo, zebrafish adulto stanno guadagnando il riconoscimento come sistema modello per una varietà di malattie umane 16-18 tra cui il melanoma e altri tumori 19-21, ferita cutanea guarigione 8,14 e Rigenerazione Tissutale 22-24. I vantaggi tecnici di questo modello di sistema sono altrettanto convincenti. Un numero crescente di linee mutanti e transgeniche sono disponibili dal non-profit, servizi centralizzati. In particolare, la mutazione progetto Zebrafish (ZMP) Presso il Wellcome Trust Sanger Institute mira a creare un allele knockout in ogni proteina gene nel genoma zebrafish. Attualmente, hanno mutato 11.892 geni, circa il 45% del genoma, con 24.088 alleli caratterizzati. Inoltre, ZMP accetta proposte e genererà knock-out gratuitamente. Metodi Recenti gene atterramento in larvale e adulto zebrafish 25-28 forniscono la flessibilità per studiare la funzione dei geni evolutivamente importanti per i quali approcci transgenici sono problematici o impraticabili. Grazie alla loro estremamente rapidi tassi di motilità di ~ 145 micron / h poco dopo creazione di culture 29, analisi possono essere completate rapidamente (di solito in 24 ore o meno). Come esperimenti possono essere concluse rapidamente e culture crescono bene a temperatura ambiente, molti degli ostacoli tecnici associati sono evitati mammiferi test di migrazione delle cellule che coinvolgono microscopio video. Inoltre, in età di serraggio bilanci di ricerca, zebrafish è facile ed economico mantenuto. La struttura e il comportamento del trapianto è complessa. Come il pesce non sanguinano quando la scala viene rimosso, è improbabile che molto più strati epidermici superficiali vengono rimossi con la scala. Cheratociti sembrano essere il tipo cellulare predominante nel espianto quando squame sono inizialmente rimossi dal pesce come la stragrande maggioranza delle cellule sembra macchiare con un anticorpo anti-E-caderina 14. Inoltre, non vi è alcuna prova di fibroblasti in coltura iniziale come giudicato dalla mancanza di vimentina colorazione mediante immunofluorescenza 14. Tuttavia, con la rimozione ripetuta scala, sembra che vi siano numerosi neutrofili nel espianto (vedi Video 1). Abbiamo identificato queste cellule come neutrofili basati su osservazioni morfologiche delle loro dimensioni, rapidamente motilità e la loro migrazione fuori dello strato di cellule quando esposto a LPS (dati non mostrati). Inoltre, queste cellule si colorano vivacemente with un anticorpo di neutrofili fattore citosolico e con una varietà di anticorpi secondari IgG, che indica che essi hanno FCRS abbondanti sulla loro superficie (dati non mostrati). Strati di cellule multiple sono presenti all&#39;interno del espianto. Microscopia confocale rivela la presenza di un solo strato vicino al bordo superiore per più di due strati di cheratinociti vicino scala con neutrofili visibili sopra, sotto, e tra i fogli keratocyte cellulare. A momenti iniziali, le cellule sul bordo del multi-layer espianto polarizzare, avviando la migrazione collettiva del cheratociti dalla espianto a tassi iniziali di ~ 145 micron / hr. L&#39;area coperta dal espianto aumenta rapidamente, portando a cellule diffusione, la tensione all&#39;interno del foglio, e un tasso ridotto di avanzamento del bordo d&#39;attacco. Interconversioni rapidi tra le cellule capo e follower si osservano sul bordo di entrata durante la formazione e la chiusura di fori spontaneamente costituiti all&#39;interno del foglio 7. ComeProcesso di EMT avviato con l&#39;espianto continua, i frammenti fogli e le cheratociti perdono la loro specializzazione, rapida motilità. Espressione genica e cambiamenti morfologici coerenti con EMT, la guarigione delle ferite, e le risposte infiammatorie si verificano entro 7 giorni di coltura con espianti presi in considerazione valida per circa 10 giorni 14.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
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		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
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zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

Grazie alle loro proprietà uniche motilità, cheratociti pesce dissociate da sono da tempo utilizzati culture espianto per studiare i meccanismi della migrazione singola cellula. Tuttavia, quando si stabiliscono espianti, queste cellule si muovono anche collettivamente, mantenendo molte delle caratteristiche che rendono individuo cheratociti un modello interessante per lo studio della migrazione: rapidi tassi di motilità, vasta lamelle ricco di actina con un cavo actina perpendicolari, e di velocità relativamente costante e direzione di migrazione. Nei primi espianti, la rapida interconversione di cellule migranti singolarmente con quelli migrazione collettivamente consente di studiare il ruolo di adesioni cellula-cellula nel determinare la modalità di migrazione e sottolinea i legami molecolari tra le due modalità di migrazione. Le cellule in espianti successivi perdono la loro capacità di migrare rapidamente e collettivamente come la transizione epitelio mesenchimale verifica e geni associati con la guarigione della ferita e l&#39;infiammazione sono espressi in modo differenziale. Così, espianti keratocyte possono servire come modello in vitro per la riepitelizzazione cutanea che si verifica durante la guarigione della ferita e può rappresentare un sistema unico per studiare i meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di un programma definito di cambiamenti di espressione genica. Una varietà di linee di zebrafish mutanti e transgeniche sono disponibili, che consente di espianti di stabilire da pesce con diversi background genetico. Questo permette il ruolo di proteine ​​diverse all&#39;interno di questi processi da affrontare univoco. I protocolli descritti qui descrivono un metodo semplice ed efficace per stabilire queste culture espianto per l&#39;uso in una varietà di saggi legati alla migrazione cellulare collettiva.

Come illustrato in figura 1, fogli di cheratinociti possono essere osservati migrare da sotto la scala poche ore istituisce cultura espianto. Di tanto in tanto, un keratocyte migrazione personalizzato che si è staccato dal foglio collettivamente la migrazione può essere osservato. Inoltre, come è stato stabilito l&#39;espianto da un pesce precedentemente pizzicate, ci sono abbondanti neutrofili migrano attraverso il foglio. Nei periodi più lunghi di cultura, i frammenti foglio keratocyte le cellule ...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Cheratociti zebrafish migrano in lastre alveolari da espianti e forniscono un modello in vitro per lo studio dei meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di epiteliale guarigione della ferita. Questi protocolli dettaglio un modo efficace per stabilire le culture espianto primarie per l&#39;uso in test di migrazione cellulare collettiva.

Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Metodi per studiare Mrp4 contenenti complessi macromolecolari nel regolamento di Fibroblasto migrazione

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

Un dispositivo per realizzare la migrazione delle cellule / Wound Healing in una piastra a 96 pozzetti

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...