Name: zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing
Uploaded: 2015-02-25T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Midwestern Universitetet College of Health Sciences Research Tilrettelegging Grant tildelt Eeh og Midwestern Universitetet Office of Research and Sponset programmer utført Grant tildelt KJL.

Denne protokollen er i samsvar med AVMA Dyrevelferd Prinsipper for omsorg og bruk av forsøksdyr, og har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Midwestern University. 1. Utarbeidelse av anestesi, Utstyr, &amp; Media <ol><li> Deklorere ca 1,5 liter vann fra springen ved hjelp av enten en kommersiell dechlorinating middel (tilgjengelig på dyrebutikker) eller ved å la vann stå i 24 timer. Få tre en L kanner og fylle hver med 500 ml deklorerte vann. Merke...

<ol>
	<li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases.">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li><li>Lacayo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+large-scale+cell+morphology+and+movement+from+local+actin+filament+growth+dynamics.">Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics.</a> PLOS Biology. 5, 233 (2007).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+locomotion+for+simple-shaped+cells.">Principles of locomotion for simple-shaped cells.</a> Nature. 362, 167-171 (1993).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Movement+of+Cell+Clusters.">The Movement of Cell Clusters.</a> J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+tension+on+protrusive+activity+and+microfilament+and+intermediate+filament+organization+in+an+epidermal+epithelium+moving+in+culture.">Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture.</a> The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+of+primary+zebrafish+keratocytes.">Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes.</a> Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Zebrafish+as+a+Model+System+for+Cutaneous+Wound-Healing+Research.">Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+pro-inflammatory+cytokines+and+metalloproteinase-1+by+TGF-b1+in+synovial+fibroblasts+from+rheumatoid+arthritis+and+normal+individuals.">Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals.</a> Clinica., &amp; Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).</li><li>Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+MMP-2+expression+and+secretion+change+with+increasing+serial+passage+of+keratocytes+in+culture.">Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).</li><li>Schnaper, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+extracellular+matrix+proteins+and+decreased+expression+of+matrix+proteases+after+serial+passage+of+glomerular+mesangial+cells.">Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells.</a> Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).</li><li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+matrix+metalloproteinase/tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+production+by+mesenchymal+stromal+cells+in+response+to+inflammatory+cytokines:+the+role+of+their+migration+in+injured+tissues.">In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues.</a> Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).</li><li>Zimmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts+from+primary+culture+-+primary+culture+cells+markedly+differ+from+fourth-passage+cells.">Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells.</a> Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system:+differential+gene+expressio.,+&amp;+morphological+changes+support+epithelial&#8211;mesenchymal+transition.">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., &amp; morphological changes support epithelial&#8211;mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li><li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+(transforming+growth+factor+b)+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures.">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li><li>Barut, B. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+zebrafish+as+a+model+for+human+disease.">Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease.</a> Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).</li><li>Yen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+heterogeneity+and+mutational+burden+of+engineered+melanomas+in+zebrafish+models.">The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models.</a> Genome Biology. 14, R113 (2013).</li><li>Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+and+Sdf-1+Pathways+Interact+during+Zebrafish+Fin+Regeneration.">Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration.</a> PLoS One. 4, e5824 (2009).</li><li>Dufourcq, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1+regulates+blastema+formation+during+zebrafish+fin+regeneration.">The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin.">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).</li><li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides.">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).</li><li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Morpholino+Approach+Using+Cardiac+Ventricular+Injection+to+Transfect+Multiple+Difficult-to-target+Tissues+in+the+Zebrafish+Larva.">Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).</li><li>Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expression+of+transgenes+in+adult+zebrafish+by+electroporation.">Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation.</a> BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+collective+migration,+leader+keratocytes+generate+tension+in+sheet+and+may+become+follower+or+individually+migrating+cells.">During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells.</a> Experimental Cell Research. In press, (2014).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models).">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models).</a> The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures:+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation.">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li><li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+zebrafish,+Danio+rerio+(cyprinidae),+using+scale+regeneration.">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+skin,+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses.">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

Den mest kritiske trinnet for suksess for keratocyte explant kulturen er slik at skalaen til å følge dyrkningsskålen for ca 2 - 3 minutter før tilsetting av kulturmediet. Omtrent 75% av skalaer vil feste seg og vokse planter (antall kulturer etablert for hvert eksperiment vil måtte justeres tilsvarende). Keratocyte ark ikke dannes rundt hver skala fjernet fra fisken og plassert i kultur av flere grunner. Først DAPI farging av eksplantater viser at noen vekter har få cellene festet, og dermed er det forventet at d...

<html> Studier av cellemotilitet har tradisjonelt fokusert på individuelt trekkende celler. Keratocytter dyrkede fra fisk og amfibier eksplantater har vist seg å være en kraftig modellsystem for å studere mekanismene til celle motilitet ved anvendelse av både eksperimentelt og matematisk modellering nærmer seg 1-6. Eksperimentelt arbeid med individuelt migrerende celler blir hjulpet av den raske, glatt glidebevegelse av cellene, og samtidig opprettholde en ensartet form, hastighet og retning. Imidlertid in vivo, celler ofte bevege seg sammen under opprettholdelse av celle-celle kryss, spesielt under embryogenese, sårheling, og metastase. Således er kollektivt cellemigrering en voksende og stadig mer fremtredende område for forskning innen cellemigrering. Den kollektive migrasjon av disse cellene har nylig blitt beskrevet 7 og det har mange unike funksjoner som gjør det til et kraftig system for å studere kollektiv celle migrasjon i en sårtilheling modell. ove_content &quot;&gt; Når skalaer er plukket fra en bedøvet voksne sebrafisk, forblir en viss epitelvev er festet til undersiden av skalaen. Når cellekulturmedium ble tilsatt, disse epitelceller, eller keratocytter, migrerer hurtig som en samlet enhet fra skalaen. Den explant kultur kan bli sett på som en epitelial sårheling modellen, der cellene migrerer bort fra eksplantatet som de ville over provisoriske matriks av en sårflaten å reetablere et intakt epitel. Nyere data tyder på at denne ex vivo dyrkningsetterligner mange funksjoner i in vivo sårtilheling i voksen sebrafisk. lukking av sår priser åtte oversette til en migrasjon hastighet lik den som ble observert i ex vivo system 7. I tillegg, i en in vivo sårheling modell, behandling med warfarin tyder på at hemostase har ingen effekt på hastighet av healing, betyr samtidig behandling med hydrokortison for å redusere immunrespons ikke forsinke reepithelialization 8 </sup&gt;. Som sebrafisk ikke blør når skalaen er fjernet fra dyret, er hemostase ikke et stort spiller. Selv om vi har funnet immunceller i eksplantater, har vi ikke studert effekten de kan ha på kollektiv celle migrasjon. Protokollen presenteres her beskriver hvordan å etablere sebrafisk keratocyte eksplantering kulturer som sikrer konsistens og reproduserbarhet for bruk i mange biologiske analyser. Disse eksplantering kulturer er en spesielt overbevisende in vitro modell for kollektiv cellemigrering av flere grunner. Først, sebrafisk keratocytter er primære celler brukes innen timer etablere eksplantering kulturer. Derfor har disse cellene ikke gjennomgått de morfologiske og genekspresjon endringer knyttet til passering av primære celler 9-13. Sekund, representerer dette systemet en modell for studiet av reepithelialization i respons til såret 14, og, som en del av responsen til såret, en epitelial til mesenchymale transition (EMT) er igangsatt prosess som gjenspeiles av endringer i genuttrykk og cytoskeletal rearrangements 14,15. Således har bakgrunns endringer i genekspresjon og motilitet som forekommer i ubehandlede celler blitt karakterisert, og tilveiebringe en forbindelse til å tolke endringer med behandling. Videre fisken keratocyte og den menneskelige keratinocyte er funksjonelt tilsvarende; begge er de primære epitelceller for sine respektive arter og spille en nøkkelrolle i epitel sårtilheling. Tredje, voksen sebrafisk er å få anerkjennelse som et modellsystem for en rekke menneskelige sykdommer 16-18 inkludert melanom og andre kreftformer 19-21, kutan sårheling 8,14 og vev gjenfødelse 22-24. Tekniske fordelene ved dette modellsystemet er like overbevisende. Et økende antall mutante og transgene linjer er tilgjengelige fra non-profit, sentraliserte anlegg. Spesifikt, Sebrafisk Mutation Project (ZMP) Ved Wellcome Trust Sanger Institute har som mål å skape en knockout allel i hver proteinkodende gen i sebrafisk genom. For tiden har de muterte gener 11892, omtrent 45% av genomet, med 24088-alleler karakterisert. I tillegg aksepterer ZMP forslag og vil generere knock-outs gratis. Nye metoder i genet knockdown i larve og voksen sebrafisk 25-28 gir fleksibilitet til å studere funksjonen til utviklingshemmede viktige gener som transgene tilnærminger er problematisk eller upraktisk. På grunn av sine ekstremt raske utbredelsen av bevegelighet av ~ 145 mikrometer / t kort tid etter etablering av kulturer 29, kan analyser være ferdig raskt (vanligvis i 24 timer eller mindre). Som forsøk kan gjennomføres hurtig og kulturer vokser godt ved RT, flere av de tekniske hindringer i forbindelse med pattedyrcelle migrering analyser som involverer videomikros unngås. I tillegg, i en alder av stramme forskningsbudsjetter, zebrafish er enkelt og billig vedlikeholdes. Strukturen og virkemåten av eksplantatet er kompleks. Ettersom fisken ikke blør når skalaen er fjernet, er det usannsynlig at mer enn den overfladiske epidermale lag fjernes med skalaen. Keratocytter synes å være den dominerende celletype i eksplantatet når skalaer blir først fjernet fra fisken som de aller fleste av cellene synes å farge med et anti-E-cadherin antistoff 14. Videre er det ingen bevis for fibroblaster i den opprinnelige kulturen som bedømmes av fravær av vimentin farging av immunfluorescens 14. Men med gjentatt skala fjerning, synes det å være mange nøytrofile i eksplantatet (se video 1). Vi har identifisert disse cellene som neutrofiler basert på morfologiske observasjoner av deres størrelse, hurtig motilitet, og deres migrering ut av cellen arket når de utsettes for LPS (data ikke vist). I tillegg er disse cellene flekken brightly viddh et antistoff til nøytrofile cytosoliske faktor, samt med en rekke sekundære IgG-antistoffer, noe som indikerer at de har rikelig FCR på sin overflate (data ikke vist). Flere cellelag er til stede i eksplantatet. Konfokal mikroskopi avslører tilstedeværelse av et enkelt lag i nærheten av den fremre kanten til mer enn to lag av keratocytter nærheten av skalaen med nøytrofiler synlige over, under og mellom de celle keratocyte ark. Ved tidlige tidspunkter, celler på kanten av det flerlags explant polarisere, initiere kollektiv migrering av keratocytter fra eksplantatet ved innledende forekomst av ~ 145 um / time. Området som dekkes av eksplantatet øker raskt, noe som fører til celle spredning, spenningen i arket, og en redusert hastighet på forhånd av den fremre kant. Rapid omdannelser mellom leder- og følgecellene er observert ved den ledende kant under dannelsen og lukking av spontant dannede hull i arket 7. EttersomEMT prosessen startet med eksplantatet fortsetter, plate fragmenter og keratocytter mister sin spesialiserte, rask motilitet. Genekspresjon og morfologiske endringer i samsvar med EMT, sårheling, og inflammatoriske responser skje innen 7 dager etter kultur med eksplantater vurderes levedyktig i ca 10 dager 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

På grunn av deres unike bevegelige egenskaper, fiske keratocytter skilt fra eksplantering kulturer har lenge vært brukt til å studere mekanismene for enkelt celle migrasjon. Men når eksplantater er etablert, disse cellene også flytte kollektivt, opprettholde mange av funksjonene som gjør enkelte keratocytter en attraktiv modell for å studere migrasjon: raske priser av bevegelighet, omfattende aktin-rik lameller med en vinkelrett aktin kabel, og relativt konstant hastighet og retning av migrasjon. I tidlige eksplantater, den raske interconversion av celler migrerer individuelt med de migrerer kollektivt gjør studiet av rollen som celle-celle adhesjon i å bestemme modus for migrasjon, og understreker de molekylære forbindelser mellom de to modusene ved migrasjon. Celler i senere explants mister sin evne til å migrere raskt og kollektivt som en epitelial til mesenchymale overgang oppstår og gener assosiert med sårtilheling og betennelse er forskjellig uttrykt. Således kan keratocyte eksplantater tjene som en in vitro modell for reepithelialization som oppstår under kutan sårheling og kan representere et unikt system for å studere mekanismene for kollektiv cellemigrering i sammenheng med et definert program av genekspresjon endringer. Et utvalg av mutante og transgene sebrafisk linjer er tilgjengelige, noe som gjør at eksplantater skal etableres fra fisk med forskjellig genetisk bakgrunn. Dette gjør det mulig rolle forskjellige proteiner i disse prosessene kan bli entydig adressert. De protokoller som er beskrevet her beskriver en enkel og effektiv metode for å etablere disse eksplantering kulturer for anvendelse i en rekke analyser knyttet til kollektiv cellemigrering.

Som illustrert i figur 1, kan observeres migrerer ut fra under omfanget i løpet av timer for å etablere et utenforliggende kultur ark av keratocytter. Noen ganger kan en individuelt migrere keratocyte som har brutt ut av den kollektivt migrere ark holdes. I tillegg, som eksplantatet ble etablert fra en fisk som tidligere var blitt revet av, er det rikelig nøytrofiler som migrerer gjennom arket. På lengre kultur perioder, de keratocyte ark fragmenter som celler gjennomgå EMT 14. <p cl...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Sebrafisk keratocytter migrere i celle ark fra eksplantater og gi en in vitro modell for studiet av mekanismene for kollektiv cellemigrasjon i sammenheng med epitel sårtilheling. Disse protokoller detalj en effektiv måte å etablere primære eksplantering kulturer for anvendelse i kollektive cellemigrerings analyser.

Sebrafisk Keratocyte eksplantater å studere Collective Cell Migrasjon og reepithelialization i Kutan Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Vurdering av endotelcelle Migration etter eksponering for giftige kjemikalier

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimalisering av Wound Scratch analysen å oppdage endringer i Murint Mesenchymale stromal Cell Migration Etter Skade ved Løselig sigarettrøyk Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stamcellelignende<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale eksplantater å studere Tidlig Neural utviklingstrekk<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; I Vivo</em&gt; Cell Migration bruker Cell transplantasjoner og Time-lapse Imaging in Sebrafisk embryo

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Metoder for å studere Mrp4 holdige makromolekylær Komplekser i forskrift av fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Utvikling av en etanol-indusert Fibrotiske Liver Modell i Sebrafisk å studere stamceller-mediert hepatocytter Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Adenoviral Gene Therapy for diabetiker keratopathy: Effekter på sårtilheling og stamcelle Marker uttrykk i Menneskerettighets Organ-dyrkede hornhinner og limbale Epitelceller

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Culture of Adult Transgene Sebrafisk Netthinne explants for Live-celle Imaging av multiphoton Mikros

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

En enhet for utøvende Cell migrasjon / Wound Healing i en 96-brønns plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...