Name: zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing
Uploaded: 2015-02-25T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos de Midwestern University College de Ciencias de la Salud Investigación Facilitación subvención concedida a EEH y medio oeste de Oficina Universitario de Investigación y Programas Patrocinados Intramural subvención concedida a KJL.

Este protocolo se ajusta a los principios de bienestar AVMA animales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y ha sido aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad del Medio Oeste. 1. Preparación de anestesia, equipos, y medios de comunicación <ol><li> Declorar aproximadamente 1,5 L de agua del grifo usando un agente comercial declorinadora (disponible en tiendas de mascotas) o dejando reposar el agua durante 24 horas. Obtener tres va...

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	<li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases.">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li><li>Lacayo, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system:+differential+gene+expressio.,+&amp;+morphological+changes+support+epithelial&#8211;mesenchymal+transition.">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., &amp; morphological changes support epithelial&#8211;mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li><li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+(transforming+growth+factor+b)+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures.">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li><li>Barut, B. 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Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin.">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).</li><li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides.">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).</li><li>Konantz, J., Antos, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures:+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation.">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li><li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. 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El paso más crítico para el éxito del cultivo de explantes de queratocitos está permitiendo que la escala se adhiera a la placa de cultivo durante aproximadamente 2 - 3 minutos antes de la adición del medio de cultivo. Aproximadamente el 75% de las escalas se adherirá y crecer hojas (necesitará el número de cultivos establecidos para cada experimento que ajustarse en consecuencia). Hojas de queratocitos no forman alrededor de cada escala extraerán de los peces y se colocan en cultivo durante varias razones. En ...

<html> Estudios de la motilidad celular se han centrado tradicionalmente en la migración de las células de forma individual. Queratocitos cultivados de pescado y explantes de anfibios han demostrado ser un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos de la motilidad celular utilizando modelos experimentales y matemáticos enfoques 1-6. El trabajo experimental en células que migran de forma individual es ayudado por el movimiento de deslizamiento rápida, suave de las células, mientras que mantiene una forma uniforme, la velocidad y dirección. Sin embargo, in vivo, las células se mueven frecuentemente colectivamente manteniendo al mismo tiempo las uniones célula-célula, en particular durante la embriogénesis, la cicatrización de heridas, y la metástasis. Por lo tanto, la migración celular colectiva es un área en crecimiento y cada vez más importante de la investigación en el campo de la migración celular. La migración colectiva de estas células ha sido recientemente descrito 7 y tiene muchas características únicas que lo hacen un potente sistema para estudiar la migración celular colectiva en un modelo de cicatrización de la herida. ove_content &quot;&gt; Cuando escalas son arrancadas de un pez cebra adultos anestesiados, algo de tejido epitelial permanece unido a la parte inferior de la escala. Cuando se añade medio de cultivo celular, estas células epiteliales, o queratocitos, migran rápidamente como una unidad colectiva de la escala. La cultivo de explantes puede ser visto como un modelo de curación de heridas epiteliales, en la que las células migran desde el explante como lo harían a través de la matriz provisional de un lecho de la herida para restablecer un epitelio intacto. Los datos recientes sugieren que este cultivo ex vivo imita muchas características de in vivo la cicatrización de heridas en adultos de pez cebra. tasas de cierre de la herida 8 se traducen a una velocidad de migración similar a la observada en el sistema ex vivo 7. Además, en una herida in vivo modelo de curación, el tratamiento con warfarina sugiere que la hemostasia no tiene ningún efecto sobre la tasa de de la curación, mientras que el tratamiento con hidrocortisona para reducir la respuesta inmune no retrasa reepitelización 8 </sup&gt;. A medida que el pez cebra no sangra cuando se retira la escala del animal, la hemostasis no es un jugador importante. Aunque hemos encontrado células inmunes en explantes, no hemos estudiado los efectos que puedan tener sobre la migración celular colectiva. El protocolo presentado aquí describe cómo establecer cultivos de explantes de queratocitos de pez cebra que garanticen la coherencia y reproducibilidad para su uso en muchos ensayos biológicos. Estos cultivos de explantes son particularmente convincente un modelo in vitro para la migración celular colectiva por varias razones. En primer lugar, los queratocitos de pez cebra son células primarias usadas dentro de los horarios de establecer cultivos de explantes. Por lo tanto, estas células no se han sometido a los cambios morfológicos y de expresión de genes asociados con el paso de las células primarias 9-13. En segundo lugar, este sistema representa un modelo para el estudio de la reepitelización en respuesta a heridas y 14, como parte de la respuesta a heridas, una epitelial a mesenquimal trproceso ansition (EMT) se inicia como se evidencia por los cambios en la expresión génica y reordenamientos del citoesqueleto 14,15. Por lo tanto, los cambios de fondo en la expresión génica y la motilidad que se producen en las células no tratadas se han caracterizado y proporcionar un contexto para interpretar los cambios con el tratamiento. Además, la queratocitos pescado y el queratinocito humano son funcionalmente equivalentes; ambas son las células epiteliales primarias de sus respectivos especies y juegan un papel clave en la cicatrización de la herida epitelial. En tercer lugar, el pez cebra adultos están ganando reconocimiento como un sistema modelo para una variedad de enfermedades humanas 16-18 incluyendo el melanoma y otros cánceres 19-21, la curación de heridas cutáneas 8,14 y el tejido de regeneración 22-24. Las ventajas técnicas de este modelo de sistema son igualmente convincente. Un creciente número de líneas mutantes y transgénicos están disponibles sin fines de lucro, instalaciones centralizadas. En concreto, el Proyecto Mutación pez cebra (ZMP) En el Wellcome Trust Sanger Institute tiene como objetivo crear un alelo nocaut en cada proteína del gen de codificación en el genoma del pez cebra. Actualmente, se han mutado 11.892 genes, aproximadamente el 45% del genoma, con 24.088 alelos caracterizados. Además, ZMP acepta propuestas y generará de forma gratuita knock-outs. Métodos recientes en caída gen en larvas y adultos de pez cebra 25-28 proporcionan flexibilidad para estudiar la función de genes de desarrollo importantes para las que los enfoques transgénicos son problemáticos o poco práctico. Debido a sus muy rápidas tasas de la motilidad de ~ 145 micras / hr poco después de establecimiento de cultivos 29, los ensayos se pueden completar rápidamente (normalmente en 24 horas o menos). Como experimentos se pueden completar rápidamente y culturas crecen bien a TA, varios de los obstáculos técnicos asociados con la que se evitan los ensayos de migración de células de mamíferos que implican la microscopía de video. Además, en la edad de apriete presupuestos de investigación, zebrafish se mantienen fácilmente ya bajo costo. La estructura y el comportamiento del explante es compleja. Como los peces no sangran cuando se retira la escala, es poco probable que mucho más que las capas epidérmicas superficiales se eliminan con la escala. Queratocitos parecen ser el tipo celular predominante en el explante, cuando las escalas se eliminan inicialmente a partir de los peces como la gran mayoría de las células parece teñir con un anticuerpo anti-E-cadherina 14. Además, no hay evidencia de fibroblastos en el cultivo inicial a juzgar por la ausencia de tinción por inmunofluorescencia 14 vimentina. Sin embargo, con extracción repetida escala, parece que hay numerosos neutrófilos en el explante (ver video 1). Hemos identificado estas células como los neutrófilos basadas en las observaciones morfológicas de su tamaño, rápidamente la motilidad, y su migración fuera de la lámina de células cuando se exponen a LPS (datos no mostrados). Además, estas células se tiñen ingenio brillantesh un anticuerpo para el factor citosólico de neutrófilos, así como con una variedad de anticuerpos IgG secundarias, lo que indica que tienen abundantes FcRs en su superficie (datos no mostrados). Múltiples capas de células están presentes en el explante. La microscopía confocal revela la presencia de una sola capa cerca del borde que conduce a más de dos capas de queratocitos cerca de la escala con neutrófilos visibles por encima, por debajo y entre las hojas de queratocitos celular. En los puntos de tiempo tempranos, las células en el borde del explante polarize multi-capa, iniciando la migración colectiva de los queratocitos del explante a tasas iniciales de ~ 145 micras / hr. El área cubierta por el explante aumenta rápidamente, dando lugar a la propagación de células, la tensión dentro de la lámina, y una disminución de la tasa de avance del borde de ataque. Interconversiones rápidos entre las células líder y seguidora se observan en el borde de ataque durante la formación y el cierre de los agujeros formados espontáneamente dentro de la hoja 7. Como elEMT proceso iniciado con el explante continúa, los fragmentos de hoja y los queratocitos pierden su motilidad rápida especializada. La expresión de genes y cambios morfológicos consistentes con EMT, cicatrización de heridas y las respuestas inflamatorias se producen dentro de los 7 días de cultivo con explantes se consideran viables durante aproximadamente 10 días 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
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zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

Debido a sus propiedades únicas móviles, queratocitos de pescado disociarse de largo se han utilizado cultivos de explantes para estudiar los mecanismos de la migración de células individuales. Sin embargo, cuando se establecen los explantes, estas células también se mueven en conjunto, manteniendo muchas de las características que hacen individuo queratocitos un modelo atractivo para estudiar la migración: las tasas rápidas de la motilidad, extensa laminillas actina-ricos con un cable de actina perpendicular y velocidad relativamente constante y dirección de la migración. En los primeros explantes, la rápida interconversión de células que migran de forma individual con aquellos que migran colectivamente permite el estudio del papel de las adherencias célula-célula en la determinación del modo de la migración, y hace hincapié en los enlaces moleculares entre los dos modos de migración. Las células en explantes posteriores pierden su capacidad de migrar rápidamente y colectivamente como un epitelial a mesenquimal se produce y genes asociados con la curación de heridas y la inflamación se expresan diferencialmente. Por lo tanto, los explantes de queratocitos pueden servir como un modelo in vitro para la reepitelización que se produce durante la curación de heridas cutáneas y puede representar un sistema único para estudiar los mecanismos de la migración celular colectiva en el contexto de un programa definido de cambios de expresión génica. Una variedad de líneas de pez cebra mutantes y transgénicos están disponibles, lo que permite explantes que se establecerán a partir de peces con diferentes antecedentes genéticos. Esto permite que el papel de las diferentes proteínas dentro de estos procesos que debe abordarse de forma única. Los protocolos descritos aquí describen un método fácil y eficaz para el establecimiento de estos cultivos de explantes para su uso en una variedad de ensayos relacionados con la migración celular colectiva.

Como se ilustra en la Figura 1, hojas de queratocitos se pueden observar la migración hacia fuera de debajo de la escala dentro de hora de establecer el cultivo de explantes. De vez en cuando, un queratocitos migración individual que se ha desprendido de la hoja colectivamente migración se puede observar. Además, como el explante se estableció a partir de un pescado que habían sido hechas anteriormente, existen abundantes neutrófilos que migran a través de la hoja. En períodos de cultivo más l...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Queratocitos de pez cebra migran en láminas de células a partir de explantes y proporcionan un modelo in vitro para el estudio de los mecanismos de migración celular colectiva en el contexto de la cicatrización de la herida epitelial. Estos protocolos detalle una forma efectiva para establecer cultivos de explantes primarios para su uso en ensayos de migración celular colectivos.

Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Métodos de estudio de complejos macromoleculares que contienen MRP4-en el Reglamento de Migración de fibroblastos

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

Un dispositivo para realizar la migración de células / Curación de Heridas en una placa de 96 pocillos

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...