Name: manipulation and in vitro maturation of xenopus laevis oocytes, followed by intracytoplasmic sperm injection, to study embryonic development
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development at JoVE.com

We are grateful to Gurdon laboratory members for useful discussion. K.M. is a Research Fellow at Wolfson College and is supported by the Herchel Smith Postdoctoral Fellowship and the Great Britain Sasakawa Foundation. Gurdon laboratory is supported by grants from the Wellcome Trust (RG69899) and MRC to J.B.G.

<ol>
	<li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B., Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+amphibian+egg+to+understand+the+mammalian+oocyte.">Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte.</a> Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. , 1-11 (2013).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li><li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos.">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li><li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus.">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li><li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos.">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li><li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+antisense+oligonucleotides+in+Xenopus+oocytes.">The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 75-81 (2010).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Wave1+is+required+for+reprogramming+transcription+in+oocytes+and+for+normal+development.">Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development.</a> Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).</li><li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming.">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li><li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter.">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li><li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li><li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection.">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li><li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+'autocatalytic'+nature+of+the+maturation+promoting+factor+(MPF)+in+oocytes+of+Xenopus+laevis.">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens.">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li><li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes.">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes &amp; development. 25 (9), 946-958 (2011).</li><li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method.">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li><li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis).">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li><li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases.">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth &amp; differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנחנו כאן פירוט שיטה חדשה לרוקן גורמים אימהיים או לביטוי יתר גורמים אקסוגניים לפני ההפריה. מערכת זו דורשת שני microinjections, אבל במקום זה מדלג הניתוח של צפרדעים, המשמש ב7,17 שיטת העברת מארח. זה הוא אופטימלי כדי להסיר את שלב ניתוח הצפרדע במונחים של טיפול בבעלי חיים. יתר על כן, אין לנו לקחת בחשבון לאיכות של צפרדעי נקבת מארח לניסויי ההעברה, מה שאומר שאנחנו יכולים להיפטר מגורם ביולוגי אחד שמשפיע על ההצלחה של ניסויים. לכן במערכת זו האיכות של ביציות שהתקבלו מצפרדעים דרוכים-PMSG היא גורם ביולוגי מרכזי שהוא מפתח לניסויים מוצלחים. האיכות של ביציות יכולה להישפט לאחר איסוף defolliculation השחלה או אחרי. אם כל חריגות שנצפו בשלבים האלה, זה אופטימלי כדי לאסוף השחלה אחרת מצפרדע חדשה. נקודה נוספת, כאשר אתה יכול לבדוק את איכות הביצית היא לאחר הבשלת ביצית. אם פחות מ -80% מprogesteronביציות שטופלו דואר להראות סימנים של התבגרות, ייתכן שלא תוכל לקבל מספיק מספר העוברים לניתוח נוסף. השימוש בdefolliculation האנזימטית במקום defolliculation הידני הוא גם יתרון נוסף של שימוש במערכת זו כדי להפחית את העבודה הדרושה לdefolliculation. עם זאת, זה עדיין אפשרי שdefolliculation הידני עשוי לתת פיתוח טוב יותר מאשר הטיפול האנזימטית. כפי שניתן לראות באיור 3, כמעט 10% במבחנה התבגרו ביציות יכולים להגיע לשלב ראשן שחייה. נתונים אלה נאספו מ -13 ניסויים עצמאיים כוללים אלה שדווחו ב- 8 וחדשים ניסויי הזרקה. שיטת העברת מארח צריך 75-150 ביציות בכל טיפול לקבלת נתונים משמעותיים מאז 30-60% מהביציות הועברו יכולים להגיע לשלב neurula 17. השיטה שלנו בדרך כלל מתחילה עם 200-300 ביציות בכל קבוצת ניסוי מאז כ 40-60% מעוברים ביקעו יכולים להגיעשלב תגובת שרירים. נתונים אלה מראים כי שני השיטות לתמוך בשיעור התפתחותי סביר. עד כה יש לנו להשיג 10 צפרדעים בחיים מביציות מוזרקות אוליגו antisense-הזריק mRNA ובקרת שליטה באמצעות טכניקה זו, מצביעה על כך שגישה זו תומכת בפיתוח באמצעות מטמורפוזה. שיטת המניפולציה-ICSI הביצית שלנו מספקת הזדמנות לבחון את תפקידם של גורמים אימהיים במהלך התפתחות עוברית בשלב מוקדם מאוד, זמן קצר לאחר ההפריה. בנוסף, ביטוי יתר של גורמי שינוי הכרומטין לפני ההפריה יכול לעשות את זה אפשרי לשפץ הכרומטין האימהי לפני ההפריה להבנת מצבי הכרומטין אימהיים הכרחיות לפיתוח. אסטרטגיה זו יכולה גם לעבוד היטב עם מערכות עריכת הגן הנוכחיות כגון nuclease תמלול כמו activator-מפעיל (Talen) 18,19 וCRISPR / CAS9 20,21 מאז אלה יכולים לבוא לידי ביטוי עוד לפני ההפריה. לכן, לגישה החדשה שלנו potentiאל לשמש ליישומים רבים בעתיד.

laevis Xenopus הוא בשימוש נרחב אורגניזם מודל רב עוצמה, ללמוד פיתוח 1. סיבה לכך הוא ביצי Xenopus הן גדול במיוחד (כ 1.2-1.4 מ&quot;מ, בהשוואה לעמיתיהם יונקים להיות על 0.1 מ&quot;מ) ושפע. ביצים מכילות רכיבים אימהיים מסונתזים ומאוחסנים, שהם מספיק כדי לנהוג התפתחות עוברית עד מעבר אמצע blastula (MBT, המתרחשות בשלב 8-8.5 עם 4,000-8,000 תאים). MBT מלווה בהפעלת הגנום zygotic, אשר לאחר מכן מייצרת מוצרי גן עובריים המכוונים את התפתחות נוספת. מחקרים רבים שמטרה לזהות גורמים אימהיים חשובים להתפתחות. מחקרים רבים מסתמכים על הזריקה של oligonucleotides antisense (oligos) כולל oligonucleotides morpholino לעוברי מופרים, ובמקרה זה פירוק של חלבונים אימהיים ניתן לצפות בשלב gastrula 2-4. לחלופין, mRNAs מוזרק להם מופריםbryos להפריע פונקציות גן או לאתר את גורלם של חלבוני ביטוי יתר. עם זאת, ההזרקה לעוברי שלב אחד תא בדרך כלל אינה משפיעה על רמות ביטוי של חלבונים אימהיים בשלבים עובריים בשלב מוקדם מאוד לפני MBT. Heasman ויילי הקימו את שיטת העברת מארח ללהתגבר על בעיה זו 5. בשיטה שלהם, ביציות defolliculated ידנית מוזרקות עם oligos antisense והועברו לנקבות מארח 6. חלבונים downregulated לפני הפריה כך שניתן לבחון תפקידים של חלבוני downregulated בהתפתחות עוברית מוקדמת. שיטת האזילה אימהית זה הובילה לזיהוי של מספר תפקידים התפתחותיים ייחודיים של חלבונים אימהיים, כפי שנסקרה ב- 7. בדוח זה, הפרט השיטה שפותחה לאחרונה, שבה דלדול אימהי או ביטוי יתר של mRNA לפני ההפריה מושגת ללא defolliculation ידני והעברת מארח8. Defolliculation הידני דורש הרבה זמן והעברת מארח לעתים קרובות צריכה טכניקות מיומנים והרישיון הספציפי לניתוח בעלי חיים, ובכך פוגעים שימוש תכוף בשיטת האזילה האימהית. Defolliculation והעברת מארח יוחלפו על ידי defolliculation האנזימטית 9,10 והזרקת זרע intracytoplasmic (ICSI) 11-13, בהתאמה. ICSI לביצים שימש במקור כדי לייצר צפרדעים מהונדסים 12. גרעיני זרע ועובריים גם הושתלו במבחנה ביציות דו-חיים התבגרו 11,14,15. כאן, אנו מציגים שיטת צעד-אחר-צעד שלנו להזריק זרע לביציות במבחנה התבגרו שהיו לפני שהוזרק עם oligos antisense או mRNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)&#160;</td>
			<td style="width:87px;">MSD Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">Vm 01708/4309</td>
			<td>PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Liberase TM Research Grade</td>
			<td style="width:87px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">05 401 127 001</td>
			<td>For oocyte defolliculation. Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:216px;">Drummond Nanoject</td>
			<td style="width:87px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">3-000-205/206</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Alpha laboratories</td>
			<td style="width:119px;">7&#8221; Drummond #3-000-203-G/XL</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:87px;">SUTTER Instrument</td>
			<td style="width:119px;">Model D-97</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td>For invitro maturation and ICSI</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">14 ml ultra-clear centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D1556</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digitonin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D141</td>
			<td>Cell permeabilization reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker</td>
			<td style="width:87px;">Hybaid&#160;</td>
			<td style="width:119px;">HB-SHK-1</td>
			<td>For oocyte defolliculation.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope (Stereo zoom microscope)</td>
			<td style="width:87px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">Semi SV6</td>
			<td>For oocyte collection and microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 &#956;m pore filter</td>
			<td style="width:87px;">CellTrics</td>
			<td style="width:119px;">04-0042-2317</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Optima L-100XP</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:87px;">Cellstar Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">227261 or 210261</td>
			<td>Oocyte collection and defolliculation reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">90 mm Petri dish&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">101VR20/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easy-Grip Cell Culture Dish, 60x15 mm</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easy-Grip Cell Culture Dish, 35x15 mm</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation and in vitro maturation of xenopus laevis oocytes, followed by intracytoplasmic sperm injection, to study embryonic development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

התפתחות עוברית של עוברי ICSI באמצעות ביציות מבחנה התבגרה נבדקה (איור 3 א). שיעורי הבשלה של ביציות GV לבמה MII משתנים ובמידה רבה תלויים באיכות הביצית. בניסויים טובים, כמעט 100% מביציות GV להגיב לסימני פרוגסטרון ותכנית של הבשלת ביצית, סוף סוף הופכים לביצים בשלב MII. כל הביציות התבגרו היו נתונים לICSI וכ -25% מביצים שהוחדרו ביקעו (איור 3 א, n = 13 לשליטה מקושקשות ביציות מוזרקות אוליגו וn = 7 ללא ביציות מוזרקות אוליגו). כ -60% או 80% מעוברים ביקעו, המופקים מביציות מוזרקות אוליגו שליטה או ביצית-הזריק עישון, בהתאמה, הגיעו לשלב blastula / gastrula. בין עוברי blastula / gastrula, כמחצית מעוברים בדגימות מוזרקת אוליגו היתה באיכות טובה (כמעט ללא סימני מחשוף נורמלי ואפופטוזיס) ואילו 82% מעוברי blastula / gastrula היו באיכות טובה בnדגימות מוזרקות על-(איור 3 א). לבסוף, 41% ו -11% מעוברים ביקעו בדגימות מוזרקות אוליגו הגיעו תגובת השרירים ושלבי ראשן שחייה, בהתאמה, ואילו 60% ו -29% מעוברים ביקעו בדגימות מוזרקות אינם עשו (איור 3 א). עוברי ICSI אלה הם התערובת של עוברים נורמלים ולא נורמלים (איור 3). חלקם עוברים מטמורפוזה ולפתח להתבגר צפרדעי 8. תוצאות אלו מצביעות על כך שהזרקה של oligonucleotides antisense לתוך ביציות GV, ואחריו IVM וICSI, מאפשרת התפתחות עוברית מוקדמת יעילה. למרות שההזרקה של oligos antisense עצמו מקטינה התפתחות עוברית, אנחנו עדיין הצלחנו להשיג מספיק עוברים למטרות ניסויים רבים כגון בדיקת שיעורים התפתחותית, RT-PCR, כתם מערבי וכן הלאה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> איור<html> יור 1: דוגמאות אופייניות של Xenopus laevis ביציות באיכות טובה או באיכות גרועה לניסויי התבגרות במבחנה. (א) דוגמא של ביציות באיכות גרועות. לדוגמא, ביציות מראים פיגמנטציה בלתי סדיר אינן משמשות לניסויים הבאים. כל Xenopus laevis ביצית היא כ 1.2-1.4 מ&quot;מ קוטר. (ב) ביצית defolliculated באופן חלקי. המחצית הימנית של הביצית היא מכוסה על ידי תאי זקיק, שניתן להבחין בנוכחותם של כלי דם. חץ מראה על שטח חופשי של תאי זקיק ושלתוכו מחט הזריקה מוזרקת. (ג) דוגמא של ביציות באיכות טובות, שהם שווים בהגודל ולהראות ההמיספרות בבעלי חיים באופן שווה עם פיגמנט ניגוד ברור בין האונה בעלי החיים וחצי הכדור הצמחי. 2,496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2:. Xenopus laevis ביציות לפני ואחרי ההתבגרות לאחר הבשלת ביצית, כתמים ברורים לבנים מופיעים בחלק העליון של ההמיספרות בעלי חיים ותאי זקיקם התקלף. כל ביצית laevis Xenopus היא כ 1 מ&quot;מ בקוטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> איור 3: פיתוח של עוברי ICSI, המופקים מביציות מבחנה התבגרה. (א) לפיתוח של עוברי ICSI לכל שלב הוא סיכם. ביציות הוזרקו שליטה מקושקשת oligonucleotides antisense (הזרקת אוליגו שליטה) או בלי הזרקה (הזרמה שאינה), ואחריו IVM וICSI. המספר המתאים של עוברים בכל שלב מוצג לעיל הסורג והבריח. ממוצע ± SEM מוצג. N = 4-13 ניסויים עצמאיים / f שונהemales. (ב) דוגמאות לשרוד עוברי ICSI. עובר שלב tailbud אלה יוצרו בניסוי אחד, שבו כ -200 ביציות שמשו כחומר מוצא.

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development at JoVE.com

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

ביטוי של חלבונים ניאון ב<em&gt; Lanceolatum מיתרני הראש</em&gt; על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...