Name: super-resolution imaging of the natural killer cell immunological synapse on a glass-supported planar lipid bilayer
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer at JoVE.com

We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children&#8217;s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+immunological+synapses.">Cytotoxic immunological synapses.</a> Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).</li><li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. u. p. f. e. r. H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+antibody-dependent+interactions+between+macrophages+and+lipid+haptens+in+planar+lipid+monolayers.">Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).</li><li>Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+lipid+monolayers+on+alkylated+planar+glass+surfaces.">Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces.</a> Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).</li><li>Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TIRF+microscopy+technique+for+real-time,+simultaneous+imaging+of+the+TCR+and+its+associated+signaling+proteins.">A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+HIV-1+envelope-induced+virological+synapse+and+signaling+on+synthetic+lipid+bilayers.">Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li><li>Michalet, X., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photon+statistics+to+boost+microscopy+resolution.">Using photon statistics to boost microscopy resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-field+optical+nanoscopy.">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+a+total+internal+reflection+fluorescence+STED+microscope+(TIRF-STED-FCS).">Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS).</a> Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).</li><li>Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+organization+and+bidirectional+vesicular+traffic+at+cytotoxic+immune+synapses.">Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses.</a> Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).</li><li>Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells.">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li><li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture.">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

現在の研究の新規性は、NK細胞のシナプスを研究するSTEDとSLBの技術を組み合わせることである。以前の研究は、T細胞のシナプス形成8を研究するためにTIRFと脂質二重層を撮像して、原形質膜6上の分子の輸送をシグナリングしている。他のものは、抗体でコーティングされたガラススライド13,14を使用してNK細胞のシナプスのSTED画像化を記載している。本明細書中にさらに記載のハイブリッド方法は、これらの脂質二重層の表面に超解像画像化によって得られる強化明確にNK細胞のシナプスを撮像する努力、より良いモデルAPCの動的表面上に構築。 のSLBは、実際の標的細胞またはAPCが有すること骨格、脂質ラフトを欠く人工膜、および他のリガンドであるが、この技術は、移動性およびリガンドの向きと重要な特徴を再現することができる。これはSLBシステムは解剖トンで還元主義的なアプローチとして機能することができますISとISのダイナミクスの形成に個々の受容体およびリガンドの寄与彼。のSLBの最も重要な特徴は、研究者はそのような共焦点及びTIRF顕微鏡法のような高分解能イメージング手法を使用して、この手法を組み合わせることができることである。 STED顕微鏡の導入は、さらに研究とその臨床応用がISに前例のない洞察を提​​供し、この利点を増大させる。 このシステムの一つの潜在的な批判は、SLBが十分に得られ、したがってシナプスにおける潜在的に非生理的解剖学的特徴を生じさせる、APCの複雑な表面を模倣しないことである。それがSLB上の表面分子の限られたレパートリーは完全にAPCの不均一人口​​表面を再現しないことは事実ですが、それがシナプス形成上の個々の受容体とリガンドの相互作用の影響を決定するために研究者を可能にするという点で、この制限は、有利であることができる。 Tここでの処理のいくつかの重要なステップがあります。最も重要なの中でのリポソームの酸化は、常にこのようなステップ1.10、2.6のように、チューブ、溶液中の酸素を置換するために、アルゴンを用いて、2.11を介して防止されることである。脂質の酸化は、このように自由に移動し、シナプスの構造に関与する表面タンパク質の能力を阻害、減少、脂質移動度をもたらす。同様に、凍結乾燥（ステップ1.2）により、リポソーム内のすべてのクロロホルムを除去することも重要です。脂質二重層中のタンパク質濃度の測定では、最初のクラスタのない均質な懸濁液にシリコンビーズを分散させるために重要である。必要であれば、ビーズの超音波処理を適用することができる。カバースリップを洗浄されるSLB、初期段階（5.1〜）を組み立てる際に、液滴が配置され、カバースリップは不可欠で固定されている。これらのいずれかでミスが（セクション5の先頭から）上で実験を開始する必要ができます。この理由のため、それは事故の場合には時間を節約するために必要とされるよりも多くのカバーガラスをきれいにすることをお勧め。 このシステムで作業しているとき、非クラスタは、最も頻繁な問題である。最後のステップで細胞を可視化する際に、1は任意の蛍光シナプスを見つけられなかった場合は、撮影することができいくつかのステップがあります。別のコグネイト細胞表面受容体のための染色細胞をガラスカバースリップまたは二重層の表面に非特異的に付着することができるが、細胞は重層とシナプスを形成していないことを確認するために、チャンバーに添加することができ、シナプス-関与する表面タンパク質べき非係合表面タンパク質は、細胞の周囲に拡散染色のように表示されます。一方で、細胞 - 二重層界面の面でのように明確なクラスタを表示されます。このメソッドは失敗した場合、1は、特定のマーカー1は、細胞表面上に十分な豊富に発現して勉強したいと考えていることを確実にするために、フローサイトメトリーを経由して 、それらの細胞を確認する必要があります。一定の表面proteインは、インビボ培養において長期間にわたり下方調節されることが知られている。 NK細胞のシナプス形成を視覚化する方法を具体的に、このプロトコルの詳細が、SLBシステムは単に、ステップ5.11において主リガンドの置換によって想像任意の免疫細胞におけるシナプス形成を研究するために使用することができる。複数のリガンドはまた、同時に添加してもよい。一つには、二重層内表面タンパク質を付着させるためのストレプトアビジン - ビオチン系を使用する必要はありません。ニッケルNTA：ヒスチジン相互作用も生存可能である。しかし、ストレプトアビジンの高強度と特異性に起因する：ビオチン相互作用、私たちの研究室ではこのシステムを好む。一つには、ステップ5.13において、所定濃度の二重層上に添加した細胞の濃度、ならびに成熟の異なる段階でシナプスを観察するために、その後のインキュベーション期間の持続時間を変えることができる。もちろん、これは細胞内のSTRを可視化する可能性を排除が、これはあっても、生きて行うことができますuctures（これらはすでに融合した蛍光タグで標識されていない限り、私たちの研究室は、いくつかのような変更された細胞株を使用しています）。これにより、プロトコルの可能な高度なカスタマイズのために、一つの基本的な脂質ダイナミクス15、シナプス形成を含む、免疫学、細胞生物学、および生化学における質問の非常に多様な範囲に対処するために、STEDイメージングと共に、基本SLB技法を使用することができ16、17細胞内シグナル伝達、および腫瘍細胞の転移18。

免疫学的シナプスは（IS）細胞の活性化と機能1の臨界接合部である。これは、抗原提示および細胞性免疫が行われることにより、主要な媒体である。シナプス形成の最も初期の顕微鏡研究は、細胞-細胞複合体システム2を利用した。このアプローチの主要な制限は、それがあったとして、複合体のほとんどは、このようにシナプスの構造自体の観察者の視界を制限する、「プロファイルで「見られることである。 1999年には、ダスティンの研究室では、以前のMcConnelラボ4,5によって開拓されていたガラスサポート脂質二重層（SLB）技術3を利用することによって、この制限に対処。このアプローチは、タンパク質が結合し、二次元で自由に移動することができたにガラスサポート脂質平面表面を支持する抗原提示細胞（APC）、処分した。この方法を使用して、ダスティンと同僚は、Tに直接バックアップピアすることができました彼は、高解像度の蛍光顕微鏡を用いて、初めてISの構造の「対面」外観を得るシナプス。 SLBシステムを用いて、ISを視覚化することが可能な詳細は、現在の画像化技術6-8の限界によって制限されている。標準照射技術を用いて、最小分解能（これらは区別することができる、請求つの異なるオブジェクト間、即ち、最小距離）は、レイリーの基準9に基づいて&lt;200nmであった。この制限は、シナプスを構成する非常に微細な、分子スケールの構造の画像化を妨害し、超解像技術の開発10-12まで、これらの構造の可視化は、電子顕微鏡を用いて固定された細胞の画像化に限定された。 そのようなSIMのような超解像技術は、種々の最近の出現により、（構造化照明顕微鏡）、PALM（光活性化ローカライゼーション顕微鏡）、STORM（stochastical光学復興顕微鏡）、およびSTED 10-12は 、研究者らは現在、順番にISのますます明確に理解を提供してきたこれまでにない詳細にこれらのシナプスの構造を研究することができます。 STED顕微鏡法の利点は、13の前に記載されている。ここでは、新たに開発された660nmの枯渇レーザーを備えたSTED顕微鏡で超解像画像を記述する。従来の592 nmの枯渇レーザーと比較して、660 nmのレーザーは、蛍光色素（http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/を参照）、特に、これらの赤色蛍光体のより広い選択が可能になる。 他の刊行物は、抗体でコーティングされたスライドガラス13,14にNK細胞のシナプスのSTED画像化を記載している。ここで、SLBシステムはNK細胞のシナプスを研究するために、超解像STED顕微鏡法と組み合わされる。この技術は、抗体を上回る利点を有している埋め込まれた表面タンパク質が平坦二次元平面（xy平面）内で自由に移動できる流動モザイクという被覆スライド。これは、より忠実に標的細胞の有機及び移動表面を模倣し、その結果、優れた生理学的に関連する免疫シナプスの形成を再現する。 このプロトコルの目的は、SLBシステムと、超解像STED顕微鏡法を組み合わせることにより、NK細胞のどの画像に免疫学的シナプスの詳細な説明と、エンドユーザに提供することである。それに必要な手順をエンドユーザに提供する：リポソームを調製し、タンパク質包埋二重層を構成する脂質二重層にタンパク質濃度を決定し、STED顕微鏡を用いて超解像画像を取得する。これらの技術は、免疫学の分野に限らず、広く、様々な分野にわたって使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1330">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:316px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:475px;">Purpose</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:283px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 
			1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:256px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:316px;">850375C</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">18:1 Biotinyl Cap PE 
			1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)</td>
			<td style="width:256px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:316px;">870273C&#160;</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Argon gas, compressed</td>
			<td style="width:256px;">Airgas&#160;</td>
			<td style="width:316px;">UN1006</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">A lyophilizer</td>
			<td style="width:256px;">Labconco&#160;</td>
			<td style="width:316px;">Freezone 7740020</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Lyophilizer tubes</td>
			<td style="width:256px;">Labconco&#160;</td>
			<td style="width:316px;">7540200</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Chromatography Columns</td>
			<td style="width:256px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:316px;">sc-205558</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1 M Tris pH 8.0</td>
			<td style="width:256px;">Ambion&#160;</td>
			<td style="width:316px;">AM9856</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">5 M NaCl</td>
			<td style="width:256px;">Ambion&#160;</td>
			<td style="width:316px;">AM9759</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">O1008</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:256px;"><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html?LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html;FrName=Spectra%2FPor+RC+Tubing;rtm=Kit;#KIT">Spectrum Labs&#160;</a></td>
			<td style="width:316px;">132676</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">96-well V-bottom polystyrene plate (untreated)</td>
			<td style="width:256px;">Corning</td>
			<td style="width:316px;">3896</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Non-functionalized silica beads</td>
			<td style="width:256px;">Bangs Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:316px;">SS06N</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:316px;">14-959-2A&#160;</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">QuantumTM MESF beads</td>
			<td style="width:256px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:316px;">Variable</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Casein&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">C0875</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">HEPES buffered saline + 1% HSA</td>
			<td style="width:256px;">Homemade</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:316px;">434301</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Fluorescently-labeled biotinylated protein&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Homemade</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td>
			<td style="width:256px;">ibidi&#160;</td>
			<td style="width:316px;">80608</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">25x75 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:256px;">ibidi&#160;</td>
			<td style="width:316px;">10812</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hydrogen peroxide (30%)</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Scientic&#160;</td>
			<td style="width:316px;">BP2633</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">258105</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">D-Biotin</td>
			<td style="width:256px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:316px;">B20656</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Lens paper</td>
			<td style="width:256px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:316px;">54826-001</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Type F Immersion Oil</td>
			<td style="width:256px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:316px;">11 513 859</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">A Leica TCS STED microscope</td>
			<td style="width:256px;">Leica</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the natural killer cell immunological synapse on a glass-supported planar lipid bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

図1は、脂質二重層上の抗体密度の結果を示す。原理は、フローサイトメトリー（A） を介して MFI対MESFの標準曲線を作成するための標準的なビーズを使用することである。サンプル列のMFIは、標準曲線を用いてMESFに変換した。脂質二重層上の抗体密度は、直線的に抗体濃度（B）と相関している。 図2ガラス支持平面脂質二重層におけるNKシナプスの三色STED画像を示す。脂質二重層上の抗CD16抗体は、Fアクチン形成及び分極およびNK細胞における免疫シナプスの焦点パネルでFアクチンメッシュパーフォリンの浸透を誘発する、蓄積する。この組み合わせたアプローチを使用して、1はきれいに直接NK細胞上のCD16のクラスタリングを反映しSLB、内抗CD16蛍光標識のマイクロクラスタを観察することができます。従来の共焦点画像を、CD16セントラの構造と比較してlのクラスタは、より容易により枯渇周囲の蛍光にSTED画像において識別される。また、アクチン細胞骨格の微細構造が大幅に向上解像度で見られる。以前の観察16,17と一致して、パーフォリン陽性溶菌顆粒はSTED画像、大部分は共焦点画像で失われている重要な詳細に低F-アクチン密度の領域の上に配置見られている。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> 脂質二重層における3G8抗体の図1の密度。（A）は 、標準シリーズのMESFおよびMFIとの間の線形相関。（B）のタンパク質濃度及び試料タンパク質の希釈系列の濃度と線形相関当たり蛍光標識されたタンパク質のモノマーの数を示す脂質でコーティングされた済州に増加する濃度の関数としての単位面積LICAビーズ。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> 平面脂質二重層におけるNKシナプスの図2 STEDイメージング。初代NK細胞は、SLBを含むビオチン化、蛍光標識された抗CD16（赤）で刺激した固定、透過処理し、その後ファロイジン（青色）および抗Fアクチンで染色した（緑色）。個々のセルは、第1、通常の共焦点設定で画像化され、その後、STED設定した。共焦点とSTED画像はホイヘンスソフトウェアを使用してデコンボリューションされた。スケールバーは1μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版については、ここをクリックしてください。</a>

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Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer (Video) | JoVE

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

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