Name: rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling
Uploaded: 2015-04-11T14:00:00
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This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

注：実験は、実験動物の管理と使用に関するカナダのガイドに従って行ったとラヴァル大学動物保護委員会によって承認された。 1.サンプルの調製注：この例では、生後1日目のマウスの脳を使用していました。 <ol><li>その後氷冷L15培地中で可能な限り迅速に脳を解剖、子犬のために3から4分間砕いた氷に低体温麻酔を使用してください。 2分以内に...

<ol>
	<li>Chung, C. 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この方法の最も重要な点は、RNAの分解を防止しながら、目的の細胞を標識することにある。 RNA分解酵素は、水溶液中でアクティブであるため、インキュベーション時間を減少させることは、RNAの保全11,15を向上させます。使用されるすべてのソリューションは、RNアーゼを不活性化するDEPCで処理しなければならない。全ての材料及び表面がRNアーゼ汚染を防ぐための表面のRNAse汚染除?...

脳は、複雑なネットワークを形成する異なるニューロンタイプの多種多様で構成されている。これらのニューロンは、それらの形態、接続性と遺伝子発現パターン1に係る個別のグループおよびサブグループに編成されています。マイクロアレイ、次世代シーケンシング、および定量RT-PCRの開発は、異なる生物学的状況1,2におけるニューロン集団の遺伝子発現プロファイルを比較するための可能性を提供する。 RNAの完全性を維持しながら、2-4これらの高感度分析は、目的の細胞型の正確な同定および単離を必要とする。蛍光活性化セルソーティング（FACS）技術が広く細胞表面マーカーおよび/または形態学に基づいて、特定の細胞型を単離するために使用されている。 FACSは、空間分解能5の完全な損失をもたらすソーティング前の細胞解離段階を必要とします。多くのニューロンの亜集団は、目での解剖学的分布に応じて互いに区別さEの脳。薄い脳切片に適用レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、高空間分解能6-8での細胞の特定の分離のための適切なオプションを提供します。 LCMの主な制限は、形態学的基準または遺伝的動物モデルで操作蛍光タンパク質レポーターに基づいて目的の細胞を同定するために必要であった。 LCMと組み合わせて、RNAの完全性を保存クイック免疫標識法を行うための新しい技術の開発が、現在、遺伝子プロファイリング実験を続行する細胞亜集団の単離を可能にする。 このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物1,9-13に記載されている。ここでは、LCMを迅速免疫標識を組み合わせることによって、複雑な組織構造内の細胞の特定のサブセットから高品質のRNAを得るための詳細な手順を示す。我々は、最大のRNA回収率を得るために重要な重要なステップを実行し、sigができるように、RNAの分解を回避する方法を示してnificantly遺伝子発現プロファイリングに影響を与える。 このプロトコルのデモンストレーションのために、1日齢のマウスの脳からドーパミン作動性ニューロンが標的とされた。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパミン合成の律速酵素に対する抗体を用いて免疫標識することができる。 TH免疫染色に続いて、ドーパミン作動性ニューロンの個人またはグループは、その後LCMを用いて単離することができる。顕微解剖した細胞を、溶解緩衝液中に収集され、そしてRNAは、RNA単離キットを用いて抽出した。品質と抽出されたRNAの量は、バイオアナライザー5を使用して測定される。用いた遺伝子発現のさらなる分析：RNA配列決定、マイクロアレイ、または定量RT-PCRは、続いて2,4,6-を行うことができる。一例として、二段階のqRT-PCRは、単離されたドーパミン作動性ドメインを捕捉し、レーザーで実証されている。 2ドーパミン作動性ニューロンのマーカー遺伝子の発現レベルの相対的定量化は、このプロトコルの選択性を示している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、高空間分解能を有する薄い組織切片から特定の細胞の単離を可能にする。効果的なLCMは、異種の組織からの細胞の亜集団の正確な同定を必要とします。 LCMのための目的の細胞の同定は、通常、形態学的基準や蛍光タンパク質レポーターに基づいています。 LCMおよび迅速な免疫標識の組み合わせは、特定の細胞型を視覚化し、周囲の組織から隔離するための代替的かつ効率的な手段を提供する。高品質RNAは、その後、純粋な細胞集団から抽出し、さらにRNA配列決定、マイクロアレイまたは定量RT-PCRなどの下流の適用のために処理することができる。このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物に記載されている。この記事の目的は、RNAの完全性を維持しながら、細胞集団の迅速な免疫標識を実行する方法を説明するために、どのようにLCMを用いて、これらの特定の細胞を単離することである。ここで、我々は説明するdは、この多段階手順1日齢マウスからの脳組織におけるドーパミン作動性細胞の免疫標識および捕捉することができる。我々は、特別な配慮に値する重要な重要なステップを強調表示します。このプロトコルは、目的の組織および種々の細胞に適合させることができる。異分野の研究者らは、おそらくこのアプローチのデモの恩恵を受ける。

RNAの完全性を維持しながら、この迅速な免疫標識手順は、目的の細胞の可視化を可能にする。 図1は、RNA抽出前に組織調製のステップを示している。凍結切片の後、ドーパミン作動性ニューロンは、（ラベルニューロンが茶色で表示されます）チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いて標識される。実験的な質問に依存、単一細胞または関心の大きい領域は、LCM（ - ...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。

迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Bio - Rad社のTotal RNA Kitを使​​用してNeuroprecursor細胞からのRNA抽出

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

ステージ固有の半ばから後半のユーティリティ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵胞の分離

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

マウス膵臓からのRNAの単離：リボヌクレアーゼが豊富な組織

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...