Name: dual labeling of neural crest cells and blood vessels within chicken embryos using chickgfp neural tube grafting and carbocyanine dye dii injection
Uploaded: 2015-05-28T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection at JoVE.co

Befruktade GFP-kycklingägg levererades av professor Helen Sang, Roslin Institute och University of Edinburgh, Storbritannien. Roslin Transgenic Chicken Facility finansieras av Wellcome Trust och av Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC). Arbetet finansierades delvis, och NT stöddes, av Great Ormond Street Hospital Children's Charity, London, Storbritannien. Författarna tackar Ben Jevans, UCL Institute of Child Health, för hjälp med att förbereda embryon för ympning.

1. Förberedelse av mikroskalel för neuralrörsblationer
<ol><li>Forma en mikroskalel från en kommersiellt tillgänglig stålsynål.<ol>
<li>Platta först ut nålen på båda sidor med ett sliphjul monterat på en driven bänkkvarn.</li>
		<li>Börja forma skalpellen, först på en grov arkansassten med en kontrollerad cirkulär rörelse, i alternativa riktningar, på båda sidor av nålen.</li>
		<li>Fortsätt med samma sliprörelser på en extra fin Arkansas-sten för att forma en ultrafin mikroskalpelel, med en väldefinierad skäreggen(figur 1A, B). OBS: Alternativ till mikroskallen kan vara elektrolitiskt slipade nålar, kommersiellt tillgängliga volframnålar eller dragna glasnålar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Inkubera vilda typ- och GFP-ägg till önskad scen
<ol><li>Förvara befruktade kycklingägg och transgena GFP-kycklingägg i en kyld inkubator vid 14 - 15 °C före inkubation eftersom utvecklingen stoppas vid denna temperatur. Förvara ägg i några dagar, upp till en vecka.</li>
	<li>För att påbörja utvecklingen, placera vildtyp och GFP-ägg på en bricka horisontellt och inkubera samtidigt i en fuktad (58- 60%) inkubatorn vid 37,5 ºC, så att embryona befinner sig i matchande stadier för neuralrörstransplantation.</li>
	<li>För att få embryon på utvecklingsstadiet 10 - 12 somit för att utföra vagal neuralrörstransplantation, inkubera ägg i 1,5 dagar (33 - 38 timmar) och arrangera embryon enligt utvecklingstabellerna i Hamburger och Hamilton21.</li>
</ol>3. Förbered ägg för fönster och ympning
<ol><li>Flytta ett ägg i taget till en specialtillverkad ägghållare för fönsterning. Gör ett litet hål i äggskalet genom att upprepade gånger knacka, med rak sax, på den övre ytan av äggets spetsiga ände.</li>
	<li>Ta bort 2 - 3 ml albumin från ägget med en 181/2 G hypodermisk nål och 5 ml spruta. Att ta bort albuminet sänker äggulan i ägget och underlättar efterföljande fönster utan att orsaka någon skada på embryot.<ol>
<li>Kassera albuminet. Försegla hålet med en liten remsa av klar tejpskuren till storlek med fin sax.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Använd böjd sax och knacka på ett annat hål i äggskalets övre yta. Sätt in saxspetsen i hålet och arbeta i en cirkulär rörelse för att skära ett fönster med en diameter på ~ 2 cm ovanpå skalet.<ol>
<li>Håll saxen i stationärt läge och rotera ägget. Kassera den borttagna skivan med äggskal. Vid E1.5 känns embryot igen som en mörkare gul skiva ovanpå äggulan.</li>
		<li>Ta bort eventuellt skalskräp som har fallit i ägget med pincett. Kassera eventuella obefruktade ägg (identifieras av en liten vit fläck ovanpå på den annars ljusgula äggulan).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Förbered värdembryon för att få ympad vävnad
<ol><li>Justera stereomikroskopet till ögonnivå och optimera orienteringen av gåshudsljuskällan för att på ett adekvat sätt belysa embryot utan att orsaka reflektioner.</li>
	<li>För att visualisera embryotordentligt , injicera en liten mängd indiskt bläck under mitten av den mörkare gula skivan, med hjälp av ett munrör och en pulled glasmikropipett (Figur 1C, Oii).<ol>
<li>Förbered bläcket 50:50 med PBS som innehåller Penicillin/Streptomycin vid 100 μg/ml slutlig koncentration. För in mikropipetten genom äggulamembranet utanför blastodermens omkrets och vinkla sedan försiktigt spetsen direkt under embryot.</li>
		<li>Leverera bläck under embryot genom att blåsa på munröret. Om munrör inte är tillåtet, använd istället en 1 ml spruta. Var försiktig så att du inte inför några luftbubblor under embryot, vilket kan leda till förorening, ta sedan försiktigt bort glasmikropipetten. Detta är ett känsligt steg som kan leda till embryots död om det inte görs med precision.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arrangera embryot med hänvisning till Hamburger och Hamilton21 och spela in scenen i en labbbok.</li>
	<li>Använd en specialtillverkade mikroskalpelel (eller en fin volframnål) monterad på en nålhållare, gör en mycket liten gash i vitellinemembranet, bredvid det område där mikrokirurgin kommer att utföras.<ol>
<li>Applicera försiktigt 2 - 3 droppar PBS över membranrevan (med en mikropipett i glas och munröret) för att skapa utrymme mellan embryot och membranet. Klipp ett större fönster i membranet för att exponera hela regionen där mikrokirurgin kommer att äga rum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ta bort det neurala rörområdet av intresse med hjälp av mikroskallen, som börjar med rostrala och kaudala tvärsnitt över hela dorsala neurala röret (på nivån somit 1 till 7 i videon).<ol>
<li>Skär bilateralt mellan neuralröret och somiterna för att separera neuralröret från omgivande vävnader, utan att skada somiterna.</li>
		<li>Separera försiktigt neuralröret från det underliggande notokordet, som ska förbli intakt. Observera att framgångsrik neuralrörsexcision kommer att lämna alla omgivande vävnader helt intakta (Figur 2).</li>
		<li>Ta bort det strukna neurala röret genom att aspirera det i en mikropipett i glas och kassera sedan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registrera nivån av neuralrörsablation i en labbbok. Värdembryon är nu redo att ta emot donatorns neuralrör.</li>
</ol>5. Förbered donatorns transplantatvävnad
<ol><li>Välj ett fönster, scenmatchat GFP-embryo genom att titta under ett fluorescerande stereomikroskop med FITC-filter. GFP-fluorescensen gör det mycket enkelt att visualisera somiterna och iscensätta embryot.</li>
	<li>När ett stegmatchat embryo har identifierats, ta bort embryot från ägget genom att göra 4 snitt, med Pascheff-Wolff vårsax (Figur 1C, l) i rektangelform runt embryot och plocka sedan försiktigt upp det med en embryosked.</li>
	<li>Placera embryot i ett fyrkantigt klockglas med en sylgardpolymerbas. Skaka försiktigt embryot med Dumont #5 pincett för att ta bort eventuell fäst äggula. Ta bort vitellinemembranet och fäst embryot på polymerbasen med hjälp av rostfria minutienstift (Figur 1C).</li>
	<li>Använd vårsaxen och gör 4 snitt i rektangulär form runt neuralröret och omgivande somiter, i samma region som har tagits bort från värdembryon.</li>
	<li>Använd en plastöverföringspipett, överför neuralröret och somitvävnaderna från donatorn GFP embryo till ett urglas som innehåller 0,2% bukspottkörtel i Pen/ Strep PBS.</li>
	<li>Låt enzymatisk matsmältning fortsätta i 10 minuter på RT för att hjälpa till att separera vävnaderna. Efter inkubation i enzym, använd rostfria minutien stift monterade på ett handtag för att manuellt separera neurala röret från alla intilliggande vävnader.</li>
	<li>Använd en mikropipett i glas, överför det dissocierade neurala röret till ett annat urglas som innehåller DMEM + 10% serum(t.ex.get, häst eller fetala kalvar) på is, för att skölja överskottet av bukspottkörtel och stoppa enzymatisk matsmältning. Efter 5 min är det dissekerade neuralröret redo att ympas ortopiskt i kycklingvärden (figur 2 och S1).</li>
</ol>6. Transplantera vävnaden
<ol><li>Använd en mikropipett i glas och överför försiktigt det dissekerade neuralröret från urglaset till värdembryon. Placera neuralröret i rätt främre bakre orientering och tryck försiktigt explanten intill kycklingvärdens strukna region med hjälp av mikroskallen. Lämna ett litet fragment av ectoderm fäst vid, eller genom att skära en liten nick i, den dorsala ytan för att identifiera neuralrörets orientering.<ol>
<li>Om det behövs, använd mikroskallen för att trimma explanten till den exakta storleken på den strukna regionen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Led försiktigt neuralröret in i det ablated området och placera det så att den dorsala sidan är korrekt orienterad. Använd en mikropipett i glas, monterad på ett munrör, för att avlägsna PBS och/eller vätska som omger transplantatet. Detta hjälper donatorn och värdvävnaderna att klibba och transplantatet att etableras.</li>
	<li>Försegla hela fönstret med 24 mm bred klar tejp för att förhindra uttorkning och förorening.</li>
	<li>Märk det chimeriska embryot genom att markera med en penna på äggskalet och registrera dess nummer i labbboken. Sätt tillbaka ägget i inkubatorn för vidare utveckling.</li>
</ol>7. Injicera DiI i blodkärl av värdembryon
<ol><li>Vid önskad experimentell tidpunkt (här, 3 - 10 dagar senare), hämta det chimeriska embryot från inkubatorn och ta bort det klara tejpen med rak sax för att få tillgång till embryot i ägget.</li>
	<li>Förstora vid behov fönstret i skalet med saxen. Var försiktig så att du inte skadar det chorioallantoiska membranet om det är fäst vid skalet, vilket skulle leda till blödning och äventyra blodkärlsmärkningen.</li>
	<li>Välj en tillgänglig ven på äggulan och se till att blodflödet riktas mot embryot. Välj en förgreningspunkt för en av vitelinvenerna (Bild 3B, C). OBS: Vid E6.5 - E7.5 kan det chorioallantoic membranet behöva försiktigt flyttas åt sidan med pincett för att komma åt äggulavenerna. Efter E8.5 är det enda alternativet att injicera i en av de chorioallantoic membrane ådrorna eftersom chorioallantoic membranet vid detta stadium helt täcker embryot.</li>
	<li>Ta bort vitellinemembranet ovanför den valda injektionspunkten med två Dumont-#5 pincett genom att riva i motsatta riktningar.</li>
	<li>Bryt en dragen glasnål med en Dumont #5 och justera dess diameter till venens ungefärliga storlek innan du laddar med CellTracker CM-DiI. Gör DiI-lagerlösningen vid 40 μg/μl i DMSO och förvara den vid -20 °C. Förbered arbetslösningen i 0,3 M sackaros/PBS vid en koncentration av 4 μg/μl.<ol>
<li>Aspirera mellan 5 - 10 μl DiI i 0,3 M sackaros/PBS i nålen med sug med munrör. Äldre embryon kan kräva upp till 25 μl eller mer. Från E8.5 har embryon större, mer muskulösa vener, som kan behöva hållas på plats med en Dumont #5 innan de huggs med den DiI-laddade glasnålen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sätt snabbt in nålen i venen och blås stadigt med munröret så att DiI kan ansluta blodflödet långsamt utan att bilda en blodpropp. Alternativt kan du använda en tryckinjektor för DiI-leverans.</li>
</ol>8. Skörda embryon för sektionering eller fullmonteringsundersökning
<ol><li>För att behålla så mycket DiI i embryot som möjligt, skörda embryot omedelbart efter injektionen genom att skopa det på en perforerad sked och skära blodkärlen och bindväven med en par raka saxar, för att frigöra embryot från äggulan.</li>
	<li>Ta bort eventuella lösa membran och dissekera ut de organ av intresse(dvs. lungornaoch matsmältningssystemet i denna handledning), var mycket försiktig så att du inte komprimerar vävnaden, vilket skapar diffusion av DiI. Fixa omedelbart vävnaderna genom nedsänkning i 4% PFA i 1- 2 timmar på RT.</li>
	<li>Skölj vävnaden i 5 minuter i PBS och sedan 15 min i PBS som innehåller 5 μg/ml DAPI. Montera proverna på en bryggad mikroskopbild för hel monteringsundersökning eller bädda in dem för kryosektionering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biological+cell+labeling+technique+and+its+use+in+expermental+embryology.">A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology.</a> Developmental Biology. 30, 217-222 (1973).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 97, 305-318 (1999).</li><li>Garcia-Castro, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+differentiation+of+the+neural+crest.+Current+Opinion+In.">Induction and differentiation of the neural crest. Current Opinion In.</a> Cell Biology. 11, 695-698 (1999).</li><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+switches+in+Mammalian+neural+crest+cell+differentiation.">Signals and switches in Mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, (2013).</li><li>Burns, A. J., Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sacral+neural+crest+contributes+neurons+and+glia+to+the+post-umbilical+gut:+spatiotemporal+analysis+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system.">The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system.</a> Development. 125, 4335-4347 (1998).</li><li>Burns, A. J., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+development:+analysis+of+the+selective+developmental+potentialities+of+vagal+and+sacral+neural+crest+cells+using+quail-chick+chimeras.">Enteric nervous system development: analysis of the selective developmental potentialities of vagal and sacral neural crest cells using quail-chick chimeras.</a> The Anatomical Record. 262, 16-28 (2001).</li><li>Burns, A. J., Delalande, J. M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+transplantation+of+enteric+nervous+system+precursors+from+vagal+to+sacral+neural+crest+results+in+extensive+hindgut+colonisation.">In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural crest results in extensive hindgut colonisation.</a> Development. 129, 2785-2796 (2002).</li><li>Burns, A. J., Champeval, D., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacral+neural+crest+cells+colonise+aganglionic+hindgut+in+vivo+but+fail+to+compensate+for+lack+of+enteric+ganglia.">Sacral neural crest cells colonise aganglionic hindgut in vivo but fail to compensate for lack of enteric ganglia.</a> Developmental Biology. 219, 30-43 (1006).</li><li>Wang, X., Chan, A. K., Sham, M. H., Burns, A. J., Chan, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+sacral+neural+crest+cell+contribution+to+the+hindgut+enteric+nervous+system+in+the+mouse+embryo.">Analysis of the sacral neural crest cell contribution to the hindgut enteric nervous system in the mouse embryo.</a> Gastroenterology. 141, 992-1002 (2011).</li><li>Goldstein, A. M., Hofstra, R. M., Burns, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+brain+in+the+gut:+development+of+the+enteric+nervous+system.">Building a brain in the gut: development of the enteric nervous system.</a> Clinical Genetics. 83, 307-316 (1111).</li><li>Delalande, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularisation+is+not+necessary+for+gut+colonisation+by+enteric+neural+crest+cells.">Vascularisation is not necessary for gut colonisation by enteric neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385, 220-229 (2014).</li><li>Anderson, R. B., Stewart, A. L., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypes+of+neural-crest-derived+cells+in+vagal+and+sacral+pathways.">Phenotypes of neural-crest-derived cells in vagal and sacral pathways.</a> Cell And Tissue Research. 323, 11-25 (2006).</li><li>Takase, Y., Tadokoro, R., Takahashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost+labeling+with+highlighter+ink+efficiently+visualizes+developing+blood+vessels+in+avian+and+mouse+embryos.">Low cost labeling with highlighter ink efficiently visualizes developing blood vessels in avian and mouse embryos.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 55, 792-801 (2013).</li><li>Bates, D., Taylor, G. I., Newgreen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neurovascular+development+in+the+forelimb+of+the+quail+embryo.">The pattern of neurovascular development in the forelimb of the quail embryo.</a> Developmental Biology. 249, 300-320 (2002).</li><li>Mayes, P., Dicker, D., Liu, Y., El-Deiry, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+vascular+imaging+in+fluorescent+tumors+using+multispectral+unmixing.">Noninvasive vascular imaging in fluorescent tumors using multispectral unmixing.</a> BioTechniques. 45, 459-460 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).</li><li>Eichmann, A., Thomas, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+parallels+between+neural+and+vascular+development.">Molecular parallels between neural and vascular development.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Medicine. 3, a006551 (2013).</li><li>Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessels+and+nerves:+marching+to+the+same+tune.">Vessels and nerves: marching to the same tune.</a> Cell. 120, 299-302 (2005).</li><li>Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+of+nerve+and+blood+vessel+wiring.">Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring.</a> Nature. 436, 193-200 (2005).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia.">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).</li><li>Senut, M. C., Alvarado-Mallart, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytodifferentiation+of+quail+tectal+primordium+transplanted+homotopically+into+the+chick+embryo.">Cytodifferentiation of quail tectal primordium transplanted homotopically into the chick embryo.</a> Brain Research. 429, 187-205 (1987).</li><li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-species+grafting+caused+extensive+and+heritable+alterations+of+DNA+methylation+in+Solanaceae+plants.">Inter-species grafting caused extensive and heritable alterations of DNA methylation in Solanaceae plants.</a> PLoS One. 8, e61995 (2013).</li><li>Freem, L. J., Delalande, J. M., Campbell, A. M., Thapar, N., Burns, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+organ+specific+commitment+of+vagal+neural+crest+cell+derivatives+as+shown+by+back-transplantation+of+GFP+chicken+tissues.">Lack of organ specific commitment of vagal neural crest cell derivatives as shown by back-transplantation of GFP chicken tissues.</a> The International Journal Of Developmental Biology. 56, 245-254 (2012).</li><li>Delalande, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+tyrosine+kinase+RET+regulates+hindgut+colonization+by+sacral+neural+crest+cells.">The receptor tyrosine kinase RET regulates hindgut colonization by sacral neural crest cells.</a> Developmental Biology. 313, 279-292 (2008).</li><li>Freem, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre;YFP+reporter+mice.">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> Journal of Anatomy. 217, 651-664 (2010).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PloS One. 5, e12674 (2010).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Metoden för intraspecies neuralrör ympning, i kombination med blodkärl märkning beskrivs här, drar full nytta av enkel tillgång till fågel embryot i ägget (jämfört med andra ryggradsdjur embryon) att studera samutvecklingen av ett element i det autonoma nervsystemet (ENS) och kärlsystemet.
För märkning av NCC-derivat harchick GFP-chickintraspecies ympningsmetod som vi beskriver ett antal fördelar jämfört med den klassiska vaktel-chick chimera-metoden som etablerades för över 40 år sedan1-3. För det första, under FITC-ljus, är GFP-fluorescens extremt ljus, i den utsträckning som GFP + celler lätt kan urskiljas i levande chimeriska embryon. Detta gör det möjligt att kontrollera transplantatets framgång i ovo, medan vaktel-chick ympning kräver att embryot avlivas, bearbetas och immunostained med QCPN, innan transplantatets framgång kan fastställas2. För det andra är GFP-uttrycket hos den transgenakycklingen GFP cytoplasmiskt, därför märker det inte bara cellkroppar utan gör det också möjligt att visualisera projektionerna av de transplanteradecellerna 22. Detta gör det möjligt att observera invecklade neuronala nätverk med hög upplösning (observera att fina projektioner bäst visualiseras när provet är immunostained med anti-GFP antikroppar). Eftersom QCPN-märkning är begränsad till vaktecellskärnan, avslöjas inte sådana nätverk med vaktel-chick chimeras. För det tredje eliminerar ympning inomarter eventuella artskillnader mellan celler i det chimeriska embryot. Eftersom vaktebryon har en kortare inkubationstid än kyckling (19 dagar jämfört med 21 dagar) har det föreslagits att vaktelceller har en högre spridningshastighet än kycklingceller, vilket potentiellt kan påverka utvecklingen av de chimeriskavävnaderna 23. Intressant nog har det också visat sig i växter att interspecies ympning kan producera omfattande förändringar i DNA metylering mönster i värden 24. För det fjärde underlättarchick GFP backtransplantationsexperiment för att ta itu med ämnen som NCC-öde och cellåtagande25. För det femte är den transgenakycklingen GFP också användbar för många andra tekniker, inklusive FACS-sortering av GFP + cell subpopulationer, organotypisk kultur av organ som innehåller GFP + celler, genetisk manipulering av GFP + ympad vävnad via elektroporering av uttrycksplasmider26, och andra bildteknik som optisk projektionstomografi27.
Neuralrörstransplantationsmetoden kan modifieras genom att mikrosurgiskt ersätta kortare mängder neuralrör. Genom att använda mindre segment av neuralrör är mikrokirurgin potentiellt mindre skadlig för embryot och överlevnaden kan förbättras. Nackdelen med att transplantera mindre neuralrör är dock att antalet GFP + NCC i värden kommer att minskas. Användare kan försöka uppnå en balans mellan mängden neuralrör som transplanteras för att ge optimal överlevnad av embryon, och antalet GFP + NCC i värdtarmen tillräckligt för att ge informativa resultat.
För kärlmålning har DiI fördelen att dess fluorescens är mycket ljus och robust. Den har också kapacitet att sprida sig under fixeringsdiftering och säkerställa färgning av de finaste öppnade kapillärerna. Eftersom det är ett viktigt färgämne kan embryon överleva injektionsproceduren och fortsätta utvecklas med ett färgat kärlsystem (upp till 24 timmar i våra händer, även om färgningen blir mer punktlig med tiden, se figur 3E). Kombinationen av chickGFP ympning med DiI vaskulär målning är därför kompatibel med levande bildbehandling. Förutom alla dessa fördelar är det viktigt att notera att vaskulär injektion endast märker luminiserade kärl och därför inte identifierar oöppnade kapillärer, endotelspetsceller eller isolerade endotelceller. Ytterligare framsteg inom fågeltransgenes skulle dock kunna ge nya sätt att kringgå sådana problem, vilket exemplifieras av experiment med Tg(tie1:H2B-eYFP) vaktembryon för att studera vaskulär morfogenesis28. En annan begränsning av denna teknik är att för effektiv kärlmärkning i embryon vid E7.5 och därefter måste större mängder färg injiceras, vilket kan göra experiment dyra. En modifiering av tekniken kan dock inkludera lågkostnads blodkärl märkningusing highlighter bläck14, även om detta tillvägagångssätt inte har provats i våra händer.
Kritiska steg i procedurerna inkluderar processen att visualisera embryot genom att injicera bläck under blastodisc. Om membranet som täcker äggulan slits av den bläckfyllda nålen i detta skede äventyras embryoöverlevnaden allvarligt. Det är också viktigt, när man förbereder ett donator neuralrör, att vävnaden inte lämnas under en alltför lång tid i bukspottkörtel (överväga ungefär 10 min som ett maximum). Långvarig exponering för bukspottkörtel skadar vävnaden och neuralröret är då svårt att hantera och det kommer inte att införlivas väl i värden. Att få erfarenhet av DiI-injektionstekniken på embryon av vildtyp är viktigt innan du injicerar chimeriska embryon, eftersom endast ett försök att injicera i allmänhet är möjligt för varje embryo. DiI-volym och nåldiameter är kritiska parametrar för varje embryo och bör bedömas på vilda, stegmatchade kontroller.
Sammanfattningsvis kan vår dubbla märkningsmetod för neuralrörstransplantation och DiI-kärlmålning i levande kycklingembryon användas för att undersöka sambanden mellan NCC och blodkärlsnätverk under organogenes. Med tanke på de mekanismer som ansvarar för att fastställa rätt mål innervation och vascularization under organ utveckling är fortfarande till stor del okända, denna metodik har potential för framtida upptäckter inom detta område.

Kycklingembryon är en ovärderlig modellorganism inom ryggradsdjursutvecklingsbiologi, inte minst eftersom dess utveckling i ovo tillåter experimentella manipuleringar som annars är omöjliga att utföra hos ryggradsdjur som utvecklas in utero. Denna tillgänglighet och lätthet i manipuleringar har lett till att kycklingembryon spelar nyckelroller i många viktiga upptäckter inom utvecklingsbiologin. Bland de mest kraftfulla teknikerna har varit användningen av vaktel-chick chimeric embryon för att studera cell ödet, en metod som banade väg för professor Nicole Le Douarin på 1970-talet1-3. I synnerhet har vaktel-chick chimeras varit särskilt användbara för att genetiskt markera och följa högvandrande neurala vapencellspopulationer (NCC) under tidig utveckling. NCC är en multipotent population av flyttande celler, som uppstår i dorsala ectoderm i utkanten av neuralröret, som ger upphov till ett brett spektrum av celltyper i hela ryggradsdjursembryon. Dessa inkluderar kraniofacial strukturer (brosk, ben, muskler), nervceller och glia (i sensoriska och autonoma nervsystemet), melanocyter och en subpopulation av celler i det endokrina systemet2,4,5. En av de viktigaste faktorerna som påverkar NCC:s öde är deras ursprungliga placering längs neuralrörets främre bakre axel. Till exempel uppstår enteriska NCC, som ger upphov till nervceller och glia i det enteriska nervsystemet (ENS), från två diskreta underpopulationer: den första belägen i vagal (kaudal bakhjärna) regionen och den andra i sakrala regionen av neuralröret6-13. Ympning av motsvarande regioner i neuralröret har varit den teknik som har valts för att permanent märka dessa celler och därefter tillåta spårning, från deras födelse i neuralrörets marginaler, till deras slutdestinationer inommag-tarmkanalen 6,7,10.
En annan embryonal manipulation som är lättare att utföra hos kyckling, jämfört med andra djurmodeller, är den vitala märkningen av kärlsystemet. När kycklingembryon utvecklas ligger det faktiskt ovanpå ett utom embryonalt kärlnätverk som cirkulerar syre och näringsämnen från äggulan. Detta tillgängliga kärlnätverk, som ligger på äggulans yta, kan användas som en inkörsport för att märka embryots utvecklande kärlsystem under organogenesis12,14-17. Intravaskulär injektion av olika färgämnen, såsom lipofila färgämne DiI, gör det möjligt att avgränsa/fläcka alla luminiserade kärl i det gryende kärlnätverket.
Eftersom utvecklande organ måste anslutas till både nervsystemet (för sensorisk och motorisk kontroll) samt kärlsystemet (för gasutbyte, vätske- och näringstillförsel), utvecklas de två nätverken tillsammans och delar slående likheter i sin förgrenandearkitektur 18-20. Här rapporterar vi embryonala manipuleringar som gör det möjligt för oss att studera den samtidiga utvecklingen av NCC-härledda ENS, tillsammans med kärlsystemet, under organogenes. Detta uppnås genom att generera kyckling chimeras via transplantation av diskreta segment av neurala röret, inklusive neurala krönet, kombinerat med vaskulär DiI injektion. Som ett framsteg från vaktel-kyckling chimeras använder vår metod transgena GFP-kycklingembryon för intraspecies ympning, vilket gör transplantationstekniken kraftfullare, när det gäller bildceller och deras projektioner, och eliminerar eventuella fördomar kopplade till artskillnader.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1160">
	<tbody>
		<tr height="58">
			<td height="79" rowspan="2" style="height:80px;width:528px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:312px;">Company&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:320px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Fertilised chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">Henry Stewart and Co, Louth, UK</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">Fertilised GFP chick eggs</td>
			<td style="width:312px;">The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Egg incubator (Profi-H Hatcher)</td>
			<td>Lyon Technologies, CA, USA</td>
			<td style="width:320px;">910-033</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:528px;">14C Incubator</td>
			<td style="width:312px;">Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK</td>
			<td style="width:320px;">Model LT2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo-microscope&#160;</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">Model MZ 12.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">DC500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:312px;">LEICA</td>
			<td style="width:320px;">IM50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Goose neck halogen cold light source</td>
			<td style="width:312px;">Advanced Imaging Concepts, Inc</td>
			<td>KL 1500 LCD&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">181&#8260;2 G hypodermic needle&#160;</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">HSWNH181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pancreatin</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">P3292</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>D5030</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>G6767</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">5ml syringe</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z248010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Mouth tube</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">A5177</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in.</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">S6018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Transfer pipettes, polyethylene</td>
			<td style="width:312px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:320px;">Z350796&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>PY8 30-0035</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved Iris Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holders (Nickel-plated pin holder)&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26018-17&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pascheff-Wolff Spring Scissors&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:320px;">15371-92</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>11251-30&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Minutien pins&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">26002-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11210-10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perforated spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10370-18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten needles (0.125mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:320px;">10130-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sellotape (clear, 24mm width)</td>
			<td style="width:312px;">Any Supplier</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution</td>
			<td style="width:312px;">VWR international</td>
			<td>101447-068&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:312px;">Dow Corning</td>
			<td>S09 512 516</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pelikan black ink</td>
			<td style="width:312px;">Pelikan</td>
			<td>211-169</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">C-7001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:312px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:320px;">D1306</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Settings for glass needle puller&#160;</td>
			<td style="width:312px;">Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller model P-86</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual labeling of neural crest cells and blood vessels within chicken embryos using chickgfp neural tube grafting and carbocyanine dye dii injection

Alla utvecklande organ måste anslutas till både nervsystemet (för sensorisk och motorisk kontroll) samt kärlsystemet (för gasutbyte, vätska och näringstillförsel). Följaktligen utvecklas både de nervösa och kärlsystemen tillsammans och delar slående likheter i sin förgrenande arkitektur. Här rapporterar vi embryonala manipuleringar som gör det möjligt för oss att studera den samtidiga utvecklingen av neurala vapen-härledda nervvävnad (i detta fall enteriska nervsystemet) och kärlsystemet. Detta uppnås genom att generera kyckling chimeras via transplantation av diskreta segment av neurala röret, och tillhörande neurala vapen, kombinerat med vaskulär DiI injektion i samma embryo. Vår metod använder transgenaGFP-embryon för intraspecies ympning, vilket gör transplantationstekniken kraftfullare än det klassiska vaktel-chick interspecies ympning protokollet som används med stor effekt sedan 1970-talet. ChickGFP-chick intraspecies ympning underlättar avbildning av transplanterade celler och deras projektioner i intakta vävnader, och eliminerar eventuella fördomar i cellutveckling kopplad till artskillnader. Denna metod drar full nytta av hur lätt det är att komma åt fågelembryon (jämfört med andra embryon från ryggradsdjur) för att studera samutvecklingen av det enteriska nervsystemet och kärlsystemet.

Figur 1 visar typiska instrument som krävs för att utföra mikrokirurgisk isolering och transplantation av neuralröret. Figur 2 visar transplantationsproceduren. Efter transplantationen screenas embryon för transplantation framgång. Detta innebär att undersöka embryot under ett stereo fluorescensmikroskop, vanligtvis morgonen efter mikrokirurgi, för förekomsten av graft-härledda (GFP +) NCC. Om transplantation har varit en framgång, kan GFP + NCC observeras i närheten av neuralröret och i tidiga migrationsvägar som leder mot framuten. Om proceduren inte har lyckats kommer GFP + NCC inte att observeras utanför neuralröret, eller om de finns i värden kan de vara i mindre antal. Dessa misslyckade embryon kasseras. Vanligtvis utförs 5-8 neuralrörstransplantationer på en dag, och av dessa är 80% framgångsrika. Orsaker till misslyckad neuralrörstransplantation inkluderar embryots död på grund av vävnadsskador som uppstår under mikrokirurgi, eller misslyckande av neuralröret att integreras i värdembryon. Det senare kan bero på dålig placering av neuralröret i värden eller från ett neuralt rör av dålig kvalitet på grund av dålig dissekeringsteknik eller från överdriven exponering för dissociationsenzym. Det inledande screeningsteget, liksom liknande senare undersökningar av GFP+-celler, är användbart eftersom det innebär att tid och resurser inte slösas bort genom att utföra experiment på embryon som inte har GFP-märkt NCC i tarmen.
Figur 3 visar förfarandet för DiI-injektion av blodkärlen. Effektiviteten/framgången för DiI-injektionstekniken beror på: för det första att skära injektionsnålen till optimal diameter för den riktade venen, för det andra en exakt gest när nålen sätts in i venen (så att den inte genomborras genom andra sidan) och för det tredje undviker att nålen ansluts under injektionen genom att blåsa i konstant hastighet. Om någon av dessa tre parametrar görs felaktigt kommer embryot att blöda ut eller behöver flera timmar för att återhämta sig innan ett andra försök görs eftersom blödningen gör det nästan omöjligt att injicera omedelbart. Framgångsrika embryon bör väljas omedelbart genom att titta under ett stereofluorescensmikroskop och måste dissekeras snabbt. I framgångsrika embryon finns dii-märkta blodkärl i hela embryot (figur 3C,D) inklusive kapillärbäddar(figur 3D).
Vid skörd av embryon och undersökning av vävnadssektioner eller fulloavstliga mag-tarmkanalen, Typiska resultat visar GFP+ NCC inom den primitiva ENS och den fina strukturen hos de DiI-märkta tarm blodkärlsnätverken (Figur 4) Fullmonterade preparat kan undersökas med hjälp av konfokal mikroskopi där bildstaplar producerar tredimensionella (3D) rekonstruktioner som visar sambanden mellan de fina projektionerna av GFP + ENS-celler och DiI-färgat kärlsystem (Figur 4 A-C; G-I; Video 1 och 2).
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig1.jpg"> Figur 1. Rekommenderade mikrokirurgiinstrument. A) Mikroskalel formad av en synål. B) fin Arkansas sten för att forma en mikroskalpelel. c) a) Rak sax, b) böjd sax, c) 5 ml spruta med 181/2 G hypodermisk nål, d) plastpipett, e) specialtillverkad ägghållare, f) svart bläck. g) fyrkantigt urglas, h) fyrkantigt urglas med svart sylgardbas, i) mikroskalel på nålhållare, j) minutienstift, k) minutien eller volframnål på nålhållaren, l) Pascheff-Wolff fjädersax, m) Dumont #5 pinezers, n) perforerad sked, oi) kort elddragen överföringsnål, oii) lång branddragen inking nål, p) munrör. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a> 
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig2.jpg"> Figur 2. Intraspecies neuralrör transplantation. Chick embryo / GFP neuralrör bilder har modifierats från Delalande et al. 12.Vaskularisering är inte nödvändig för tarmkolonisering av enteriska neurala vapenceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig3.jpg"> Figur 3. Intravenös DiI injektion. a) Rekommenderade instrument: a) CellTracker CM-DiI droppe på parafilm, b) dragen glasinsprutningsnål, c) munrör. B)Schematiskt diagram över intravenös DiI-injektion i E4-chimeriskt kycklingembryon. c) i ovo DiI intravenös injektion som visar fin glasnål som innehåller DiI insatt i ven (pil). (D) E4 chimeric embryo post DiI injektion (röd) med GFP + neurala rör (pil). e) DiI-färgat fint blodkärlsnätverk i ett levande embryo, 24 timmar efter injektionen. Br: hjärna; H: hjärta; LB: lem knopp; A: allantois. Bilder i (C) och (D) har ändrats från Delalande et al. 12 (på 12) Vascularization är inte nödvändigt för gut kolonisering av enteriska neurala vapenceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52514/52514fig4.jpg"> Figur 4: Representativa resultat i magen och caecum av ett E5,5-kycklingembryon. Jag är inte så bra på att se till att det finns en 3 dimensionell (3D) återuppbyggnad av en konfokal bild stack i regionen magen visar (D) GFP + enteric neurala vapenceller (ENCC) (E) DiI färgade Vaskulär systemet och (F) en sammanslagen bild av båda nätverken D-F Histologiska sektioner på nivån av magen visar (G) GFP + ENCC (H) DiI färgade kärlsystemet och (I) en sammanslagen bild av båda nätverken. Atomkärnor är färgade med DAPI (cyan). (G-H) 3D-rekonstruktion av en konfokal bildstack i caecum-regionen som visar (A) GFP+ ENCC-migreringen fram i grönt, (B) DiI-färgat kärlsystem i rött och (C) en sammanslagen bild av båda nätverken. Bilder (A-F) har ändrats från Delalande et al. 12 (på 12) Vascularization är inte nödvändigt för gut kolonisering av enteriska neurala vapenceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/52514fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/52514/52514figS1.jpg"> Figur S1. Isolering av en givare GFP + neurala rör från de omgivande vävnaderna genom enzymatisk matsmältning och mikro-dissekering. A) GFP+ neuralrör och angränsande somiter dissekerade från donatorembryon. (B) Isolerat neuralrör efter bukspottskörtet matsmältning och mikro-dissekering med hjälp av rostfritt minutien stift. Så: somiter; NT: neuralt rör; Nc: Notochord.
<img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/52514/52514video1.jpg"> Video 1. 3-dimensionell 360° rotation av bilden i figur 4C, som visar kärlsystemet och ENCC i magen vid E5.5 (HH27-28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video1.avi" target="_blank">Klicka här för att se den här videon.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/52514/52514video2.jpg"> Video 2. 3-dimensionell 360° rotation av bilden i figur 4I, som visar kärlsystemet och ENCC-migreringen framtill i caecumregionen vid E5.5 (HH27-28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52514/JoVE_Video2.avi" target="_blank">Klicka här för att se den här videon.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection at JoVE.co

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Här rapporterar vi dubbel märkning av neurala vapenceller och blodkärl med hjälp av chickGFP neuralrör intraspecies ympning kombinerat med intra-vaskulär DiI injektion. Denna experimentella teknik gör det möjligt för oss att samtidigt visualisera och studera utvecklingen av det NCC-härledda (enteriska) nervsystemet och kärlsystemet, under organogenes.

Dubbel märkning av neurala vapenceller och blodkärl i kycklingembryon med chickGFP neuralrör ympning och karbalybocyanin färgämne dii injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkt Induktion av humana neurala stamceller från perifert blod hematopoetiska progenitorceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Odling av humana pluripotenta och neurala stamceller i en sluten cellodlingssystem för Basic och preklinisk forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flera Photon Time Lapse Imaging att visualisera utvecklingen i realtid: visualisering av migrera Neural Crest celler hos zebrafiskar embryon

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Generering av inducerade neurala stamceller från perifera mononukleära celler och differentiering mot dopaminerga neuron prekursorer för transplantations studier

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dissektion, kultur och analys av primära kraniella neurala krön celler från musen för studiet av neurala Crest cell delaminering och migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurala differentiering med hjälp av Single-cell kultur av mänskliga embryonala stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Isolering, kultur och adipogenic Induktion av neurala Crest Original Fett-Härledda stamceller från periaorektisk fettvävnad

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Differentiering och karakterisering av neurala stamceller och nervceller från mus embryonala stamceller

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Ett optimerat O9-1/Hydrogel-system för att studera mekaniska signaler i neurala vapenceller

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

Murin neural platta inriktning av In Utero Nano-Injection (NEPTUNUS) vid embryonal dag 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...