Name: imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

Biz insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinde yerel Ca 2 + olayları görüntüleme ayrıntılı prosedürler sunuyoruz. Bu prosedürler, çoğu hücre tipinde 8-10 görüntü hücre içi Ca + 2 sinyallere uyarlanabilir. Hücreler 1. Hazırlık <ol><li> Kültür hücreleri tedarikçinin Web sitesinde listelenen talimatlara göre yansıması için. </li><li> Görüntü vermeden önce birkaç gün, hasat hücreleri, 1 ml 0.25% tripsin / EDTA (2-3 dakika) kulla...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication.">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling.">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li><li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling).">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li><li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate.">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li><li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores.">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li><li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca(2+)+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li><li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells.">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li><li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity.">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li><li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

Biz burada açıklamak floresan Ca 2 + göstergeleri kullanarak kültürlü memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için protokolleri. Ayrıca, kimlik ve elde edilen verilerin analizi otomatik bir sezgisel kullanıcı arayüzü ile bir algoritma tanımlamaktadır. Burada tarif edilen prosedür floresan Ca 2 + göstergesi Cal-520 kullanmak, ancak Flu-3, Flu-4, Flu-8 ve Oregon Yeşil BAPTA-1 gibi diğer birçok Ca 2 + duyarlı boyalar görüntü Ca yeterince ...

Kalsiyum iyonları (Ca 2+) yayg gen ifadesi, sekresyon ve sinaptik plastisite 1 uzun ömürlü değişiklikler dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin, çeşitli bir yelpazede düzenler. Ca 2 + Böyle farklı bir şekilde hareket hangi aracılığıyla bir yolu Ca 2+ farklı mekansal ve zamansal desenleri ile bir hücre oluşturabilir sinyalleri. Sitozolik örnek küresel yükselme düz kas dokusu 2 ise daha küçük [Ca 2+] tetik daralma, lokalize geçici yükselmeler (yerel Ca 2 + mikro bölgeler) için öğrenme ve bellek 3 için gerekli gen ifadesini teşvik. Ücretsiz sitozolik [Ca 2 +] ~ 100 nM dinlenme tutulur, fakat hızla Ca ile sitozolüne Ca 2+ akını aşağıdaki birkaç mikro-molar plazma zarı ve yanında bulunan 2 + -geçirgen iyon kanallarını çıkabilir hücre içi s Ca 2+ kurtuluştores. Bizim laboratuvar endoplazmik retikulum (ER) zarında bulunan Ca 2 + bırakma kanalı oluşturan inositol 1,4,5-trifosfat alıcısı (IP 3 R), odaklanır. Reseptör siteleri aktive sitozolik hem IP 3 ve Ca 2+ bağlanması üzerine, IP 3 R kanalı Ca 2 + ER lümeninde tecrit kurtarmak açılır. Ca 2+ salınımı uzamsal (Ca 2 + puf 4) 2+ Ca yerel sitozolik mikro oluşturmak için IP 3 Rs küçük bir küme sınırlı kalabilir veya IP 3 Rs komşu kümelerinin yakınlığı bağlı olabilir Ca 2+ indüklediği Ca 2 + -salınımı (YÜÇAM) 5,6 süreciyle birden puf siteleri işe bir hücre boyunca yaymak. Gelişmiş mikroskobu IMAGI ile birleştiğinde Tsien 7 Roger tarafından geliştirilen floresan küçük moleküllü Ca 2+ gösterge boyaların tanıtımı,teknikleri ng, Ca 2+ sinyalizasyon anlayışımızı büyük katkı sağlamaktadır. Mikroskopi için kullanılan kameralar son gelişmeler şimdi böyle görülmemiş mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip ponponları gibi geçici yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için izin verir. Şu anda mevcut EMCCD kameralar&gt; 500 kare saniye -1 (fps) ve tamamlayıcı metal oksit yarı iletken yeni nesil 128 x 128 piksel ile görüntüleme sağlayan (CMOS) kameralar biraz daha yüksek pahasına yüksek piksel çözünürlük, ve hatta daha hızlı sağlamak gürültü seviyeleri. Toplam iç yansıma (TIRF) mikroskopi ile birlikte bu görüntüye artık tek Ca 2 + kanal olayları 8,9 mümkündür. Impracticable manuel işleme, görsel kimlik ve analiz hale ve otomatik algoritmalarının geliştirilmesi yapma yükümlülüğü büyük veri setleri (min başına yaklaşık 1Gb) oluştururken Bu yaklaşım, aynı zamanda kanal / olayların yüzlerce görüntüleme için izin verir. 2 + göstergeleri kullanarak sağlam memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme prosedürlerini ve protokolleri sunuyoruz. Biz daha TIRF ve geleneksel geniş alan epi-floresan (WF) mikroskopi hem görüntülü yerel Ca 2 + olayların belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak kodlu ortam Python geliştirilen bir algoritma göstermek. Biz IP Ca 2 + sinyalleri -generated 3 bağlamında bu yaklaşımları açıklamak rağmen, [Ca 2 +] Ca çeşitli ya yüzeye bulunan 2+ -geçirgen iyon kanallarını yayılan sitozolik yerel değişiklikleri incelemek için kolayca mükellef olan Membran ya da hücre içi organellerin 8-10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1055">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:813px;">Name</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue No.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cal-520/AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21130</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>cag-iso-2-145-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO/20% pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA/AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E-1219</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm glass-bottom imaging dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Sitosolik Ca + 2 iyonları, gen transkripsiyonu, elektriksel uyanlabilirliği ve hücre çoğalması gibi çok kapsamlı işlemlerin kontrol, hemen hemen tüm hücre tiplerinde hücresel aktivitesi sayısız yönlerini düzenleyen. Ca 2 + sinyalizasyon çeşitliliği ve özgünlüğü yerel geçici Ca 2 + microdomains dakika süre boyunca meydana gelen hücre çapında titreşimler ve dalgalar arasında değişen Ca 2 + sinyalleri farklı zaman ve mekansal ölçekler üzerinde hareket oluşturulur hangi mekanizmalar, türemiştir (Ca 2+ ponponları) kalıcı milisaniye. Elektron son gelişmeler CCD (EMCCD) kameralar artık&gt; 500 kare saniye -1 (fps) oranlarında 128 x 128 piksel mekansal çözünürlüğe sahip yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme için izin çarpılır. Bu yaklaşım son derece paralel ve tek bir deneyde kanallar veya puf sitelerin yüzlerce eşzamanlı izlenmesini sağlar. Ancak, verilerin büyük miktarlarda üretilen (yaklaşık 1 Gb per dk) 2+ olayları uygulanamaz yerel Ca görsel kimlik ve analiz kılıyor. Burada tarif ve satın alma, algılama için prosedürleri göstermek ve geniş alan epi-floresan (WF) ve toplam iç yansıma ikisini de kullanarak Ca 2 + göstergeleri ile yüklenen sağlam memeli hücrelerinde Ca 2+ sinyalleri aracılı 3 yerel IP analizi floresan (TIRF) mikroskopi. Ayrıca, bu yerel Ca 2 + sinyallerin belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak yazılım ortamı Python içinde geliştirilen bir algoritma tarif. algoritma alt piksel çözünürlüğe sahip Ca 2+ sürümü siteleri lokalize; veri kullanıcı gözden sağlar; ve bir Excel uyumlu tabloda genlik ve kinetik verileri ile birlikte floresan oranı sinyallerinin zaman dizilerini çıktılar.

Şekil 1A, CI-IP 3 yüklü insan nöroblastoma SH-SY5Y hücrelerinin Cal-520 floresan dinlenme bir WF görüntüsünü gösterir. Fotoğraf-sürüme 100 milisaniye UV flaş bu hücrelerin Pozlama i-IP 3 (Şekil 1A beyaz çevreler tarafından not) ayrık siteleri geçici Ca 2 + ponponları ortaya çıkardı. Bu sitelerde ölçülen Floresan izleri yavaş yavaş bırakma sitesinden yayılan 2+ Ca gibi bir çok yavaş düşen faz (Şekil ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...