Name: delivery of in vivo acute intermittent hypoxia in neonatal rodents to prime subventricular zone-derived neural progenitor cell cultures
Uploaded: 2015-11-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures at JoVE.com

The authors acknowledge funding sources responsible for this work: 5K12HD055929 (HHR), 5R01NS080180-02 (DDF).

HINWEIS: Alle tierischen Verfahren in diesem Protokoll sind mit Zustimmung der University of Florida Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt und sind in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Grundversuchsaufbau Bevor intermittierende Hypoxie Verwaltung <ol><li> Expose Welpen 12 zu den verschiedenen Gasmischungen unter Verwendung eines Ganzkörper-Maus Plethysmographen Kammern in der gleichen Weise wi...

<ol>
	<li>Studer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proliferation,+survival,+and+dopaminergic+differentiation+of+CNS+precursors+in+lowered+oxygen.">Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen.</a> J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).</li><li>Chen, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+regulates+survival+and+fate+of+mouse+central+nervous+system+precursors+at+multiple+levels.">Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels.</a> Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).</li><li>Ling, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+intermittent+hypoxia+elicits+serotonin-dependent+plasticity+in+the+central+neural+control+of+breathing.">Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing.</a> J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).</li><li>Mitchell, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+Intermittent+hypoxia+and+respiratory+plasticity.">Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity.</a> J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).</li><li>Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+long-term+facilitation+requires+5-HT+receptor+activation+during+but+not+following+episodic+hypoxia.">Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).</li><li>Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pathways+to+phrenic+motoneurons+are+enhanced+by+chronic+intermittent+hypoxia+after+cervical+spinal+cord+injury.">Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury.</a> J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).</li><li>Baker-Herman, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+is+necessary+and+sufficient+for+spinal+respiratory+plasticity+following+intermittent+hypoxia.">BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia.</a> Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).</li><li>Zhu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+rat+brain+after+intermittent+hypoxia.">Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia.</a> Brain Res. 1055, 1-6 (2005).</li><li>Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+exposure+to+intermittent+hypoxia+enhances+mice+performance+in+water+maze+and+8-arm+radial+maze+tasks.">Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks.</a> Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).</li><li>Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoxia+on+the+proliferation+and+differentiation+of+NSCs.">Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs.</a> Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).</li><li>Ross, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intermittent+hypoxia+elicits+enhanced+expansion+and+neuronal+differentiation+in+cultured+neural+progenitors.">In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors.</a> Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).</li><li>Fuller, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+recovery+of+hypoxic+phrenic+responses+in+adult+rats+exposed+to+hyperoxia+for+the+first+month+of+life.">Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life.</a> J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).</li><li>Fuller, D. D., Fregosi, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatiguing+contractions+of+tongue+protrudor+and+retractor+muscles:+influence+of+systemic+hypoxia.">Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia.</a> J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).</li><li>Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+plasticity:+differential+actions+of+continuous+and+episodic+hypoxia+and+hypercapnia.">Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia.</a> Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).</li><li>Marshall, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+neurospheres+from+CNS+tissue.">Production of neurospheres from CNS tissue.</a> Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph...

Das Ziel dieser Methode ist es, reproduzierbar und effizient zu liefern intermittierende Anfälle von systemischen abgesenkt Umgebungssauerstoff zu neonatalen Nagetiere. Der Grund für die Verwendung intermittierender Hypoxie (IH) Stammzellen biology manipulieren stammt von in vitro Zellkulturexperimente, in denen O 2 -Gehalt des Wachstumsmediums verändert wird. Insbesondere im Vergleich zu &quot;normalen&quot; Bedingungen von 20% O 2, verlängerte Kultur von Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen Zellen in 3% O 2 führt zu einer erhöhten Proliferation, Apoptose verringert und erhöhte neuronale Ausbeute 1,2. Diese Gruppe hat umfangreiche Erfahrungen mit der Verabreichung von systemischen IH und hat umfangreiche Studien über die Rolle der IH in Atem Plastizität 3-7 durchgeführt. Diese Arbeit und die jüngste Entdeckung, dass chronische IH erhöhte Neurogenese im Nagetier CNS 8-10, bildet die Grundlage für die Erforschung der akuten in vivoHypoxie als Vorkonditionierung Stimulus (dh., vor der Gewebeernte) auf die anschließende Kultur von neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPC) 11. Bemerkenswert ist, wenn die Maus Jungtiere wurden auf eine kurze (&lt;1 Stunde) Zeit der akute intermittierende Hypoxie (AIH) ausgesetzt sind, Zellen, die aus der Subventrikularzone (SVZ) geerntet wurden, hatten signifikant erhöhte Kapazität für die Expansion als Neurosphären oder anhaftenden Monolayer-Zellen. AIH Protokoll wurde auch mit einer erhöhten Expression eines &quot;neuronalen Schicksals&quot; Transkriptionsfaktor (Pax6) zugeordnet ist. Dementsprechend wird in vivo AIH Protokolle kann ein Mittel zur &quot;prime&quot; NPCs vor der Kultur zu schaffen. Beispielsweise könnten Anwendungen für diesen Ansatz sind die Erweiterung Zellpopulationen vor der Transplantation in das verletzte Zentralnervensystems, oder einfach die Erhöhung der neuronalen Differenzierung von kultivierten Zellen vor der in vitro-Experimente. Ferner kann, da dies eine systemische Verabreichung, jedeOrgan, Gewebe oder Zellen, ist ein Kandidat für ähnliche Studie. Daher ist das Protokoll geschrieben potenziell für eine breite Palette von Studien über intermittierende Sauerstoff Manipulation in kleinen Säugetieren. Es gibt bestimmte Vorteile für diese Vorgehensweise. In anderen veröffentlichten Arbeiten wurden Neugeborenen als ein Wurf mit der Staumauer in Unterdruckkammern, die für die Langzeitanwendung vor der Behandlung ermöglicht, weniger Handling behandelt und gepflegt mütterlichen Kontakt während der Behandlung 9. Der derzeitige Ansatz umgeht wiederholten Behandlungen zu einer Zuchthündin, oder die Verwendung einer anderen Damm für jedes Experiment. Dieses Protokoll erlaubt auch Studium der präzisen Wurf abgestimmt und altersangepassten Neugeborenen. Repräsentative Daten zeigen eine weitere wesentliche Stärke dieses Protokolls, nämlich die Schnelligkeit, mit der AIH, wie geliefert, löst eine leistungsstarke und einheitliche biologische Reaktion in neuronalen Stammzellbiologie. Dies schafft einen Präzedenzfall für dieses Protokoll, um Gewebe- und Zellebene biologi entlockencal Änderungen, die Zellbiologie zu ändern. Dieser Bericht wird die detaillierten Verfahren zur Belichtung von Nagetier Welpen zur AIH sowie die Populationsanalyse der SVZ-Zellen als Neurosphären verwendet gewachsen zu skizzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="768">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:243px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mouse plethysmography chambers</td>
			<td style="width:147px;">Buxco</td>
			<td style="width:136px;">PLY4211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Flow meter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Porter</td>
			<td style="width:136px;">F150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Bias flow unit</td>
			<td style="width:147px;">AFPS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Baseline Gas Mix</td>
			<td style="width:147px;">Airgas</td>
			<td style="width:136px;">AIZ300</td>
			<td>Compressed Air</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hypoxic Gas Mix</td>
			<td style="width:147px;">Airgas</td>
			<td style="width:136px;">X03NI72C2000189</td>
			<td>10% Oxygen, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Oxygen Meter</td>
			<td style="width:147px;">Teledyne</td>
			<td style="width:136px;">AX-300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of in vivo acute intermittent hypoxia in neonatal rodents to prime subventricular zone-derived neural progenitor cell cultures

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo &#8220;pre-conditioning&#8221; stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.

Die ersten Versuche, basierend auf historischen Daten, wurden unter Verwendung von 1 min Zykluslängen durchgeführt. Auf der Grundlage der nachfolgenden Kalibrierungen in Schritt 2 durchgeführt wird, wurde bestimmt, dass das O 2 in der Kammer, betrug 13% nach 1 min nach dem Spülen und Hypoxie, sie habe eine ähnliche Zeit, um die 21% Grundlinie zurück. Allerdings war eine 2 Minuten-Zyklus aus, um beides zu erreichen 10% Sauerstoff und eine Rückkehr zu 21% während des &quot;Baseline&quot; Zyklus. Anschli...

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Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Dieser Artikel beschreibt die Methodik für die Verwaltung von kurzen Perioden intermittierender Hypoxie zu postnatalen Tag 1-8 Maus oder Ratte Welpen. Dieser Ansatz effektiv löst eine robuste Gewebeniveau &quot;Priming-Effekt&quot; an kultivierten neuralen Vorläuferzellen, die innerhalb von 30 Minuten von Hypoxie Exposition geerntet werden.

Lieferung von<em&gt; In-vivo-</em&gt; Akuter intermittierender Hypoxie in Neonatal Nagetiere in den Prime Subventrikularzone abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellkulturen

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Echtzeit Live-Zelle Durchflusszytometrie, Calcium Zustrom, Porenbildung und Phagozytose durch P2X7-Rezeptoren im Erwachsenen neurale Vorläuferzellen zu untersuchen

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell der Maushirnverletzung mit therapeutischer Transplantation von humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuralzellen

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...