Name: delivery of in vivo acute intermittent hypoxia in neonatal rodents to prime subventricular zone-derived neural progenitor cell cultures
Uploaded: 2015-11-02T15:00:00
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The authors acknowledge funding sources responsible for this work: 5K12HD055929 (HHR), 5R01NS080180-02 (DDF).

참고 :이 프로토콜의 모든 동물 절차는 플로리다 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학의 승인을 실시하고 &#39;실험 동물의 관리 및 사용을위한 안내서&#39;을 준수하고 있습니다. 1. 기본 실험 세트까지 간헐적 저산소증 관리하기 전에 <ol><li> 다른 실험 목적을위한 5,13,14 성인 설치류만큼 동일하게 전신 마우스 plethysmograph 챔버를 사용하여 상이한 가스 혼합물?...

<ol>
	<li>Studer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proliferation,+survival,+and+dopaminergic+differentiation+of+CNS+precursors+in+lowered+oxygen.">Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen.</a> J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).</li><li>Chen, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+regulates+survival+and+fate+of+mouse+central+nervous+system+precursors+at+multiple+levels.">Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels.</a> Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).</li><li>Ling, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+intermittent+hypoxia+elicits+serotonin-dependent+plasticity+in+the+central+neural+control+of+breathing.">Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing.</a> J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).</li><li>Mitchell, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+Intermittent+hypoxia+and+respiratory+plasticity.">Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity.</a> J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).</li><li>Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+long-term+facilitation+requires+5-HT+receptor+activation+during+but+not+following+episodic+hypoxia.">Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).</li><li>Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pathways+to+phrenic+motoneurons+are+enhanced+by+chronic+intermittent+hypoxia+after+cervical+spinal+cord+injury.">Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury.</a> J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).</li><li>Baker-Herman, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+is+necessary+and+sufficient+for+spinal+respiratory+plasticity+following+intermittent+hypoxia.">BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia.</a> Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).</li><li>Zhu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+rat+brain+after+intermittent+hypoxia.">Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia.</a> Brain Res. 1055, 1-6 (2005).</li><li>Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+exposure+to+intermittent+hypoxia+enhances+mice+performance+in+water+maze+and+8-arm+radial+maze+tasks.">Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks.</a> Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).</li><li>Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoxia+on+the+proliferation+and+differentiation+of+NSCs.">Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs.</a> Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).</li><li>Ross, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+intermittent+hypoxia+elicits+enhanced+expansion+and+neuronal+differentiation+in+cultured+neural+progenitors.">In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors.</a> Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).</li><li>Fuller, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+recovery+of+hypoxic+phrenic+responses+in+adult+rats+exposed+to+hyperoxia+for+the+first+month+of+life.">Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life.</a> J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).</li><li>Fuller, D. D., Fregosi, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatiguing+contractions+of+tongue+protrudor+and+retractor+muscles:+influence+of+systemic+hypoxia.">Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia.</a> J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).</li><li>Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+plasticity:+differential+actions+of+continuous+and+episodic+hypoxia+and+hypercapnia.">Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia.</a> Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).</li><li>Marshall, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+neurospheres+from+CNS+tissue.">Production of neurospheres from CNS tissue.</a> Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph...

이 방법의 목적은 재현성과 효과적으로 신생아 설치류에 전신 낮아 주변 산소의 간헐적 인 관찰을 제공하는 것입니다. 줄기 세포 생물학 조작 간헐적 저산소증 (IH)를 사용하는 이론적 근거는 성장 배지 2 O의 함유량이 변경되는 시험 관내 세포 배양 실험에서 유래. 20 %의 &quot;표준&quot;조건 O 2, 증가 확산의 3 % O 2 결과 줄기 / 전구 세포 집단 세포의 확장 된 문화에 비해 특히, 세포 사멸을 감소 신경 수익률 1,2 증가했다. 이 그룹은 전신 IH의 관리에 상당한 경험을 가지고 있으며, 호흡 소성 3-7 IH의 역할에 대한 광범위한 연구를 수행하고있다. 이 작품, 만성 IH은 설치류 CNS 8-10에 신경을 증가하는 최근의 연구 결과는 생체 내에서 급성의 탐사를위한 기초를 형성전처리 자극으로 저산소증 (예., 조직 수확 이전에) 신경 줄기 / 전구 세포 (NPC들) (11)의 연속 문화. 마우스 새끼가 급성 간헐적 저산소증 (AIH)의 개요 (&lt;1 시간) 기간에 노출되었을 때 놀랍게도, 뇌실 영역 (SVZ)에서 수확 된 세포는 크게 neurosphere를 또는 부착 단층 세포와 같은 확장을위한 용량을 증가했다. AIH 프로토콜은 또한 &quot;신경 운명&quot;전사 인자 (PAX6)의 발현 증가와 관련이 있었다. 따라서, 생체 내에서 AIH 프로토콜이 &quot;소수&quot;의 NPC 전에 문화 할 수있는 수단을 제공 할 수있다. 예를 들어,이 방법에 대한 응용 프로그램은 손상된 중추 신경계에 이전에 이식 세포 집단을 확장하거나 이전의 시험 관내 실험에 배양 된 세포의 신경 세포 분화를 증가 포함 할 수있다. 또한,이 전신 전달을하기 때문에, 어떠한기관, 조직 또는 세포는 유사한 연구를위한 후보입니다. 따라서 작성된 프로토콜은 작은 포유류 간헐적 산소 조작에 관한 연구의 다양한 잠재적으로 적용될 수있다. 이 방법의 특정 이점이있다. 게시 된 다른 연구에서 신생아가 치료에 앞서, 만성 투여 덜 처리를 할 수 있습니다 기압 성 챔버의 댐과 쓰레기로 취급하고, 치료 9시 산모의 접촉을 유지 하였다. 현재의 접근법은 사육 여성, 또는 각각의 실험에 대해 다른 댐의 사용을 반복 치료를 무시. 이 프로토콜은 또한 정확한 쓰레기 일치 및 연령대 신생아의 연구를 할 수 있습니다. 대표적인 데이터는이 프로토콜의 또 다른 키 강도, AIH는 전달과 같은 신경 줄기 세포 생물학에서 강력하고 일관된 생물학적 반응을 이끌어있는 즉 신속성을 보여줍니다. 이 조직 - 및 세포 수준 biologi을 유도하기 위해이 프로토콜에 대한 선례를 확립세포 생물학을 변경 CAL 변경됩니다. 이 보고서에 AIH 설치류뿐만 아니라 새끼 neurosphere를 성장 중 SVZ 세포의 집단 분석을 노광에 사용되는 세부 과정을 개설 할 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="768">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:243px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mouse plethysmography chambers</td>
			<td style="width:147px;">Buxco</td>
			<td style="width:136px;">PLY4211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Flow meter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Porter</td>
			<td style="width:136px;">F150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Bias flow unit</td>
			<td style="width:147px;">AFPS</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Baseline Gas Mix</td>
			<td style="width:147px;">Airgas</td>
			<td style="width:136px;">AIZ300</td>
			<td>Compressed Air</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hypoxic Gas Mix</td>
			<td style="width:147px;">Airgas</td>
			<td style="width:136px;">X03NI72C2000189</td>
			<td>10% Oxygen, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Oxygen Meter</td>
			<td style="width:147px;">Teledyne</td>
			<td style="width:136px;">AX-300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of in vivo acute intermittent hypoxia in neonatal rodents to prime subventricular zone-derived neural progenitor cell cultures

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo &#8220;pre-conditioning&#8221; stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.

기록 데이터에 기초하여 초기의 실험은, 1 분의 사이클 길이를 이용하여 수행 하였다. 상기 단계 2에서 수행되는 후속 캘리브레이션에 기초하여, 그것이 21 % 기준선으로 돌아 유사한 시간 걸렸다, 챔버 내의 O 2 레벨이 1 분 후 저산소증 플러싱에서 13 %라고 결정 하였다. 그러나, 2 분주기의 10 %를 달성 산소 및 &quot;기준&quot;사이클 동안 21 %로 복귀시키기에 충분한 양이었다. 이어서, 2 분주기...

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Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

이 문서에서는 출생 후 하루 1-8 마우스 또는 쥐 새끼에 간헐적 저산소증의 짧은 기간을 관리하는 방법을 설명합니다. 이러한 접근은 효과적 저산소증 노출 30 분 이내에 수확 배양 신경 전구 세포에 대한 강력한 조직 수준 &quot;프라이밍 효과&quot;를 도출한다.

배달<em&gt; 생체</em&gt; 급성 간헐적 저산소증 신생아 설치류에서 국무 뇌실 지역 유래 신경 전구 세포 배양에

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Delivery of In Vivo Acute Intermittent Hypoxia in Neonatal Rodents to Prime Subventricular Zone-derived Neural Progenitor Cell Cultures

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

연구

발생학

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

칼슘 유입, 기 공 형성 및 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7에 의해 식 균 작용을 조사 하기 위해 실시간 라이브 셀 Cytometry

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...