Name: human dupuytren's ex vivo culture for the study of myofibroblasts and extracellular matrix interactions
Uploaded: 2015-04-18T14:00:00
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The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.

Dieses Protokoll folgt den LUMC und AMC Richtlinien der menschlichen Forschung Ethik-Kommission. 1. Chirurgisches Verfahren und Gewebeentnahme Hinweis: Obwohl verschiedene Techniken zur chirurgischen Entfernung der Morbus Dupuytren vorhanden sind, ist der derzeitige Goldstandard die Teil Fasziektomie 15. Die meisten Patienten sind in der Tageschirurgie behandelt. <ol><li> Führen Operation unter Vollnarkose nach Präferenzen des Patienten und Anästh...

<ol>
	<li>Shih, B., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+understanding+and+clinical+management+of+Dupuytren+disease.">Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease.</a> Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).</li><li>Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+different+characteristics+of+Dupuytren's+disease+fibroblasts+derived+from+either+nodule+or+cord:+expression+of+&#945;-smooth+muscle+actin+and+the+response+to+stimulation+by+TGF-&#946;1.">The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of &#945;-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-&#946;1.</a> The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).</li><li>Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. 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J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+regulates+expression+of+the+TGF-beta+1+gene.">Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene.</a> The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).</li><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions.">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).</li><li>Gottrup, F., &#197;gren, M. S., Karlsmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+use+in+wound+healing+research:+A+survey+focusing+on+in+vitro+and+in+vivo+adult+soft+tissue.">Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue.</a> Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).</li><li>Gudjonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+tumor-derived+myoepithelial+cells+differ+in+their+ability+to+interact+with+luminal+breast+epithelial+cells+for+polarity+and+basement+membrane+deposition.">Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition.</a> Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).</li><li>Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+architecture+and+function:+dynamic+reciprocity+via+extra-+and+intra-cellular+matrices.">Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).</li><li>Jokinen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+cell+adhesion+to+type+I+collagen+fibrils.">Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).</li><li>Au-Yong, I. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+3D+Cell+Rearrangements+Guided+by+a+Fibronectin+Matrix+Underlie+Somitogenesis.">Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis.</a> PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).</li><li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos.">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li><li>Karkampouna, S., de Julio, M. 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Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon.</a> Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).</li><li>Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins.">Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins.</a> Methods. 29 (1), 97-109 (2003).</li><li>Boulesteix, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micrometer+scale+ex+vivo+multiphoton+imaging+of+unstained+arterial+wall+structure.">Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure.</a> Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).</li><li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling.">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).</li><li>Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+controls+granulation+tissue+contractile+activity+and+myofibroblast+differentiation.">Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation.</a> The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).</li><li>Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+force+monitor+for+measurement+of+contraction+forces+generated+in+human+dermal+fibroblast+cultures:+evidence+for+cell-matrix+mechanical+signalling.">A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).</li><li>Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+&#945;-smooth+muscle+actin+determines+the+contractile+phenotype+of+Dupuytren's+nodular+cells.">Post-transcriptional regulation of &#945;-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).</li></ol>

Die kritischsten Schritte der Kultivierung ex vivo menschlichen Bindegewebes sind die sofortige Verwendung des Gewebes nach der operativen Entfernung der Rentabilität zu gewährleisten; Das Gewebe sollte in Medium oder Kochsalzlösung zu jeder Zeit bleiben; Aufrechterhaltung einer sterilen Kultur; Querschnitten von Gewebe sollte maximal 200 &amp; mgr; m Dicke zu haben; Einrichten der Ex-vivo-Kultursystem ist optimal, wenn Gewebe in Kontakt mit dem Medium, aber nicht vollständig untergetaucht. Medium ...

Dupuytren-Krankheit (DD), bewirkt eine gutartige fibroproliferative Krankheit Permanent Beugung der Finger aufgrund der Bildung von Knötchen und Leitungen in der Handfläche der Hand. Obwohl die Krankheit verbreitet ist besonders hoch bei Kaukasiern in Nordeuropa, die zugrunde liegenden genetischen Ursache der Erkrankung ist unbekannt 1. Das Hauptmerkmal der DD ist die Überproduktion von extrazellulärer Matrix (ECM), Proteine ​​(zB Kollagen), die den Raum zwischen den Sehnen und Haut der Handfläche der Hand und der Finger besetzen eine harte Fasergewebe zu bilden, die feinen Bewegungen dauerhaft gestört der Hand 2, 3. Die Wiederauftreten der Krankheit schlägt zugrunde liegenden genetischen Veränderungen als Ursache der Fibrose 1, 4. Eine wirksame Behandlung sein könnte, um direkt zielen auf die unkontrollierbare fibrotische Mechanismen auf zellulärer und molekularer Ebene. Unsere jüngsten Arbeiten zur Fibrose hat uns zur Entwicklung einer LED-neuartigen 3D Kultursystem, das Kurzzeitkultur der menschlichen fibrotischen Gewebes, die das Potenzial von Drogentests ermöglicht. Dieses System hat dazu beigetragen, die einschränkender Versuch 2D Fibroblastenkulturen zu überwinden und eine Rolle zum teilweisen Abregulation durch Exon-Skipping erreicht, von TGFß Stoffwechselwegaktivierung der Vermittlung Fibrose 5 definieren. Wir haben ein Verfahren zur ex vivo-Kultur menschlicher Resektionsproben aus DD-Patienten, die Wechselwirkung zwischen Myofibroblasten und der umgebenden ECM 5, 6 studieren entwickelt. Das Studium der DD Bindegewebe Fibrose sowie anderer fibrotischer Erkrankungen beruht auf histopathologische Analyse des ausgeschnittenen chirurgischen Proben, Isolation von Fibroblasten aus dem Gewebe und Etablierung von Primärkulturen oder Zellsortierverfahren. Diese Ansätze sind ziemlich statisch, da sie exogener Manipulation der Krankheit Eigenschaften oder therapeutischen Intervention vom Experimentator nicht zulassen. Außerdem primären cell Kulturen neigen dazu, zu den Kulturbedingungen anpassen und ihre Genexpression Eigenschaften unterscheiden sich im Wesentlichen aus der in vivo Situation bei jedem Durchgang, auch während der frühen Passagen (unter Durchgang 3 und 6) 7, 8. Es ist uns gelungen, den Abfall chirurgisches Material in zu erhalten Ex-vivo-Kulturbedingungen für eine Zeitdauer, die Studie über die patientenspezifische Eigenschaften und das Screening von anti-fibrotische oder entzündungshemmende Medikament Verbindungen ermöglicht. Das System wird auf eine Nitrocellulosemembran, die einen Kontakt des Gewebes mit dem Medium, jedoch nicht mit dem Kunststoff ermöglicht somit die Verhinderung der Veränderung des Gewebes bei der Befestigung, wie zuvor beobachtet, wenn die Kultivierung DD Fibroblasten sowie andere Zelltypen 9 basiert. Kein Kollagengel oder andere ECM-Protein Substrat erforderlich, da die DD Gewebe selbst produziert große Mengen dieser Proteine. Dies ist für die Erhaltung der nativen ECM-Mikroumgebung und Umsätze sin vorteilhaftce Matrix Substrate sind wichtiger Regulator der Gewebearchitektur und Funktion 10, 11. Zum Beispiel ECM Proteine, wie Fibronectin, Laminin und Kollagen kann von vorne nach hinten Polarität Fibroblasten ähnlich für apikal-basal Polarität in Epithelzellen 12 gezeigt, 13 beeinflussen . polarisierte Zellen haben asymmetrische Verteilung der extrazellulären Moleküle, die Zellmigration und Genexpression, zB α1β1 Integrin Zugänglichkeit auf die Membran wirkt Zelladhäsion an Kollagen Typ I 14 bestimmt. Da ein Hauptziel dieses 3D-Modell war es, die einheimischen Mikroumgebung zu erhalten, wurde keine künstlichen ECM Matrixsubstrat verwendet. Kurz: Resektion Proben sind gleichmäßig in einer sterilen Umgebung abgeschnitten und auf nitrocellular Membranen gelegt. Wenn die Behandlung mittels Injektion verabreicht wird benötigt das Gewebe injiziert werden, nachdem sie auf der Membran platziert. Wenn die Behandlung nicht benötigen, um über inj verwaltet werdenection dann wird die Verbindung zu dem Kulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 1% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin (P / S)) zugefügt. Die Kulturen werden für höchstens zehn Tage nach dem das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert, durch 30% Saccharose-Lösung verarbeitet werden, in OCT-Verbindung eingebettet und bei -80 ° C gelagert gehalten, wie zuvor beschrieben 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>high glucose, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PIHA01250</td>
			<td>0.45um pore size, 12mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1310-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- &#945; smooth muscle actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type III</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1330-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylsalicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsccope glass coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>BB024060A1</td>
			<td>24x60mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope SuperFrost slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>AA00000102E</td>
			<td>76x26mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 II confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710 NLO upright confocal microscope</td>
			<td>Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA 
			water-immersion objective.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human dupuytren's ex vivo culture for the study of myofibroblasts and extracellular matrix interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Verfahren ex vivo, 3D-Kultur des Bindegewebes ist eine einfache und robuste Aufbau-System, um die Beziehung zwischen ECM und andere Zellbestandteile der DD Gewebe bilden und möglicherweise andere Arten von Fibrose als auch zu verstehen. Außerdem erlaubt dieses System eine zuverlässige Methode, um die Wirkungen der Verbindungen auf die verschiedenen Zelltypen und deren Auswirkungen auf den fibrotischen Last 20 zu testen. Die Schritte von Gewinnung von Operationsabfälle...

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Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Morbus Dupuytren (DD) ist ein fibroproliferative Erkrankung der Handfläche der Hand. Hier stellen wir ein Protokoll zur Kultur Resektionsproben aus DD in einem dreidimensionalen (3D) Kultur-System. Solche Kurzzeitkultur-System ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und molekularen Eigenschaften des fibrotischen Gewebe.

Menschen Dupuytren&#39;sche<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur für das Studium der Myofibroblasten und extrazellulären Matrix-Interaktionen

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

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Ex vivo-Kultur der Patient Tissue &amp; Prüfung von Gentransfer

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

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Strategische Endothelzell Tubusbildung Assay: Ein Vergleich extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktor Reduzierte Extrazellulärmatrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...