Name: evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay
Uploaded: 2015-02-20T13:00:00
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A assistência técnica fornecida por Jaipreet Bharj. Este trabalho foi apoiado por subsídios da UE-FP7 (SYSCILIA -241.955) e The Dutch Kidney Foundation (CP11.18).

Declaração de Ética: Animal de manutenção, criação e procedimentos são definidos e controlados pelos Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. Todos os experimentos com animais foi efectuada ao abrigo de licenças concedidas pelo Ministro da Administração Interna (PIL No. 70/7892), em conformidade com Biológica Serviços de Gestão do Grupo e da Comissão de Ética do Serviço Biológica, SGUL, Londres, Reino Unido. Foram feitos todos os esforços para reduzir o número de animais utilizados para refinar e...

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Zebrafish oferecer uma ferramenta valiosa para modelar doença genética humana, a sua utilização como um instrumento científico para a pesquisa in vivo têm permitido estudos detalhados sobre a repartição genética de muitos sistemas biológicos, incluindo o rim. Muito se agora sabe sobre como o rim zebrafish desenvolve e funções. As semelhanças com nefrogênese humana e homologia com a doença que causa genes 21 ilustrou como peixe-zebra tornaram-se fundamentais na compreensão de ...

O rim humano desempenha um papel crucial na filtragem de resíduos metabólicos do sangue e recuperando os solutos necessários para manter a homeostase celular. Há um número de doenças genéticas humanas que causam disfunção renal. A doença renal hereditária mais comum é a doença renal policística autossómica dominante (ADPKD) caracterizada pelo desenvolvimento de sacos cheios de fluido dentro dos túbulos nefríticos; os danos causados ​​por cistogénese é prejudicial para a função renal a 10. ADPKD tem uma ocorrência de 1: 800-1: 1000 e responsável por 8 - 10% de doentes com insuficiência renal em fase terminal (ESRF) 11. Vários genes têm sido implicados para causar ADPKD incluindo policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), representando cerca de 85% e 15% dos casos, respectivamente, 12,13. Além disso, os produtos do gene PKD1 para localizar e -2 para o cílio e são fundamentais para ciliogênese 14,15. Existe agora uma família reconhecida de doenças genéticas humanas, conhecidas comoos ciliopathies, que afetam a função dos cílios e resultam em CKD 16. O crescente número de doenças genéticas humanas que afetam o desenvolvimento e função ciliar está despertando o interesse global nesta organela vestigial uma vez considerado. O cílio, uma saliência celular cabelo semelhante, é enriquecido com os receptores e canais necessários para a transdução de eventos de sinalização celular chave de iões. O cílio consiste de um axoneme à base de microtúbulos, normalmente estruturada em nove duplas de microtúbulos dispostos radialmente com ou sem um par central de microtúbulos singletos. A estrutura axonemais define o tipo e modo de acção ciliar. O arranjo de microtúbulos 9 + 2 confere a motilidade do cílio, onde é utilizada no movimento de fluidos através de superfícies epiteliais. A configuração 9 + 0 é não móveis, mas acredita-se principalmente a função em eventos de sinalização celular 17. Além de CKD, as conseqüências da disfunção ciliar são um conjunto de característicasciliopathy características que incluem, obesidade, degeneração da retina, polidactilia, e disfunção cognitiva 16. No entanto, a DRC está entre as mais prejudiciais para a qualidade de vida do paciente e, portanto, uma importante força motriz por trás do desenvolvimento adequado em modelos in vivo para ciliar relacionado CKD. O peixe-zebra é um excelente modelo para compreender a etiologia da doença genética humana. O seu desenvolvimento rápido, a produção de um grande número de ovos, tecido transparente, e crescimento ex utero permite que os processos de desenvolvimento de peixe-zebra para ser visualizado e eventos biológicos manipulados com facilidade considerável. Genes podem ser geneticamente alterada usando o recente sucesso de ferramentas de edição do genoma (CRISPR 18 e TALENS 19), derrubou usando antisense tecnologia morfolino 20, ou farmacologicamente regulado pela adição de compostos ao seu ambiente aquático. De fato, peixe-zebra oferecer uma plataforma para realizar experiments que não são permissivas em outros modelos animais. Embora peixe-zebra são animais vertebrados relativamente simples (em comparação com os seres humanos) que partilham muitos órgãos funcionalmente conservadas, genes e processos de sinalização em comum com os seres humanos. Por exemplo, o rim do peixe-zebra é notavelmente semelhante em estrutura e função de comparação para os seres humanos 21,22. No entanto, ao contrário do rim de mamíferos que se desenvolve através de uma sucessão de fases, cada uma marcada por um rim mais desenvolvida (pronephros, mesonephros e metanephros), o peixe-zebra embrionário desenvolve apenas um pronephros, a forma mais imatura de um rim. Enquanto milhões de nefrónios podem ser encontrados formando os blocos de construção de rim de mamífero, o embrião do peixe-zebra possuem apenas dois. Os glomérulos, que permitem o filtrado do sangue inicial, são fundidos na linha média ventral apenas para a aorta. Filtros de sangue através dos glomérulos nos túbulos pronephric que correm caudalmente ao longo do eixo, fundindo antes de sair através da cloaca. O pronephric tutúbulos são fortemente ciliada com cílios motilidade que são permissivas para o fluxo de filtrado para o caudal de saída de 3,4. Esta estrutura pronephric simples mantém a homeostase do peixe-zebra através de várias semanas de crescimento larval onde eventualmente evoluir para uma estrutura mais complexa mesonephros 21. No entanto, o peixe-zebra nunca desenvolve um metanephros 21. Apesar das idiossincrasias de peixe-zebra, o néfron peixe-zebra é segmentado, com perfis de expressão gênica iguais aos observados em mamíferos e, portanto, oferece uma inigualável no modelo vivo para nefrogênese 3,22. Rotineiramente, os pacientes são testados quanto à função renal através de uma série de análises de sangue e urina. Tipicamente, o sangue é analisado por sais dissolvidos, ureia e creatinina. Altos níveis de ureia, creatinina e concentrações anormais de sal são indicativas de problemas com a função renal. O exame de urina usando uma vareta colorimétrico detecta níveis anormais de proteínas, Blood, pus, bactérias e açúcar presente em amostras de urina. Tais ensaios requerem normalmente cerca de 30 ml de urina ou de 5 - 10 ml de sangue. Tem sido difícil de traduzir estes tipos de ensaios para pequeno em organismos modelo in vivo, tais como o peixe-zebra, principalmente devido à natureza impossível de recolha de sangue ou de urina suficiente para realizar o ensaio. Aqui, vamos abordar a falta de testes de função do rim zebrafish adequadas e descrever uma técnica inovadora para o seu estudo. Ao injectar um corante fluorescente para a corrente sanguínea que são capazes de monitorizar e quantificar individualmente ao longo do tempo a filtração e a excreção de actividade fluorescente a partir do sangue pelo rim. Este método pode ser usado para estudar os danos causados ​​por doença renal, que fornecem um exemplo de.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

O embrião de peixe-zebra oferece um modelo tratável para estudar a organogênese e modelo de doença genética humana. Apesar da sua relativa simplicidade, o rim do peixe-zebra e desenvolve funções em quase da mesma maneira como os seres humanos. Uma diferença importante na construção do rim humano é a presença de milhões de nefrónios em comparação com o peixe-zebra que possui apenas dois. No entanto, simplificando um sistema tão complexo em unidades funcionais básicas ajudou nossa compreensão de como o rim desenvolve e opera. No peixe-zebra, a linha média localizada glomérulo é responsável pela filtragem do sangue inicial em duas túbulos pronephric que divergem para funcionar bilateralmente a partir do eixo embrionário antes da fusão para o outro na cloaca. Os túbulos pronephric são fortemente povoada por cílios motilidade que facilitam a circulação de filtrado ao longo do túbulo segmentada, permitindo a troca de vários solutos antes de finalmente sair através da cloaca 2-4. Muitos genes responsáveis ​​pela DRC, including aqueles relacionados à ciliogênese, têm sido estudadas em peixes-zebra 5. No entanto, um grande atrativo para trás tem sido a dificuldade em avaliar a função renal zebrafish após manipulação genética. Ensaios tradicionais para medir a disfunção renal em humanos provaram não translacional de peixe-zebra, principalmente devido ao seu ambiente aquático e pequeno porte. Por exemplo, não é fisicamente possível para extrair sangue de peixes embrionários encenado para análise do teor de ureia e creatinina, como eles são muito pequenos. Além disso, o peixe-zebra não produzem urina suficiente para testar em um simples proteinúria &#39;vareta&#39;, que muitas vezes é realizado durante os exames iniciais dos pacientes. Descreve-se um ensaio fluorescente que utiliza a transparência óptica do peixe-zebra para monitorar quantitativamente a depuração de um corante fluorescente, ao longo do tempo, a partir da vasculatura e para fora através do rim, para dar uma leitura de função renal 1,6-9.

A síndrome de Bardet-Biedl (BBS) é um ciliopathy heterogêneo rara que afeta cerca de 1: 160 mil pessoas em todo o mundo 16. Os pacientes apresentam uma série de problemas associados, incluindo rins policísticos, posteriormente pacientes frequentemente necessitam de diálise ou transplante renal 24. ESRF é a causa mais comum de morte em BBS, com cerca de 30% dos pacientes em desenvolvimento CKD 16. Actualmente, 20 genes não relacionados têm sido implicados em BBS sem associação ...

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

O peixe-zebra é uma ferramenta popular para modelar doença renal crônica (DRC). No entanto, seu pequeno tamanho torna impossível avaliar a função renal através de métodos tradicionais. Nós descrevemos um teste de eliminação fluorescente rim corante 1, que permite a análise quantitativa da função renal zebrafish em CKD.

Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Research

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Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

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In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...