Name: loop-mediated isothermal amplification (lamp) assays for the species-specific detection of eimeria that infect chickens
Uploaded: 2015-02-20T14:00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens at JoVE.com

The work carried out in this study was supported in part by the Royal Veterinary College through the student research projects fund, as well as the Biotechnology and Biological Sciences Research Council and the Department for International Development (grant number BB/H009337/2). This manuscript has been assigned the reference PPB_00795 by the RVC.

1. Şablon hazırlama Not: tavuk enfekte yedi Eımerıa türü birinden türetilen DNA ihtiva ettiğinden şüphelenilen herhangi bir genomik DNA şablon lamba tabanlı Eimeria türleri tanımlanması için bir şablon olarak kullanılabilir. Burada açıklandığı gibi alan teşhis analizi için bağırsak doku örnekleri rutin otopsi sırasında alınmalıdır. <ol><li> Bağırsak bölümünde (veya bölümler) seçin test edilecek. Örnek site seçimi için bir rehber ve örnekleme siteleri dağıtımı ve konumu türe özgü aralığı için 18, mevcut ve Şekil 1 olması en muhtemel Eimeria türleri için Tablo 1&#39;e bakınız. NOT: Eimeria özellikle ev sahibi sitesi özeldir çünkü bu anahtar öneme sahiptir. Tavuk bozar Her türün bu 19 hedef bağırsak bölgeye göre tanımlanır. Karar bir veya mo önceki çiftlik deneyimi, ilgi etkilenebilirBelirli Eimeria türlerinin ya da diğer tanısal göstergelere 6 yeniden. </li><li> Tüketim 5 cm veya daha Eimeria steril makas veya bir bisturi bıçağını kullanarak test etmek için seçilen bağırsak bölüm (ler) in daha uzunlukları. İsteğe bağlı olarak, örneğin RNAlater 18 ya da% 95 etanol içinde, örneğin bir sabitleyici olarak bir sonraki analiz için numune depolamak. Not: etanol numune depolamak steril Tris-etilendiamintetraasetik asit iyice yıkanmalıdır (TE), kullanımdan önce tampon. </li><li> Uzunlamasına açık örnek kesin ücretsiz steril cam mikroskop lamı kenarına ya da bir etanol / alev sterilize makas bıçak kullanarak mukoza tabakasının hücreleri en bağırsak içeriği kaldırmak (varsa) ve kazıyın. İsteğe bağlı olarak, bir araya getirilmiş numune için tek bir tüp içerisinde türe özgü bağırsak tüm siteleri dört gelen hücreler bulunmaktadır. </li><li> 1 de dahil olmak üzere 100 ul steril TE tamponu ihtiva eden bir steril 1.5 ml&#39;lik vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpü içine kazınmış malzemenin koyun0% (ağırlık / hacim) Chelex® 100 reçinesi elde edildi. </li><li> 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde her bir örnek çalkalayın. Vida üst sıkıca kapalı olduğundan emin olun ve daha sonra 10 dakika boyunca bir kaynar su banyosunda inkübe. </li><li> Kaynatıldıktan sonra her bir numune 1-2 dakika süre ile oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li><li> Santrifüj 1 dakika en yüksek hızda (örneğin, ~ 10.000 xg) mikrosantrifüj kullanarak her örnek. </li><li> Her Lamba tayininde şablon gerçekleştirilecek olmak Elde edilen üstte 2 ul toplayın. İsteğe bağlı olarak, çok-taraflı bir deney temin etmek üzere tek bir tüp içerisinde birden fazla bağırsak sitesi havuz. </li></ol> 2. Eimeria LAMBA Astar Hazırlama (Ön-deneyi) <ol><li> 100 tahliller için yeterli Eimeria LAMBA astar stokları hazırlayın: <ol><li> (Üretici tarafından belirtildiği gibi), 100 uM bir konsantrasyona kadar moleküler sınıf su ilave edilerek her bir liyofilize Eimeria lamba primeri sulandırın. Belirtilen değilse, moleküler sınıf su gerekli usin hacmini hesaplamakg her bir primerden fiziksel ve moleküler ağırlıkları. </li><li> Her Eimeria türleri için ayrı 0.5 ml flip-top mikrosantrifüj tüp içine Pipet 60 ul moleküler sınıf su tahlil edilecek. </li><li> Ekleme primerleri FIP BIP F3, B3, yedi türe özgü primer karışımları, bir dizi oluşturma Tablo 2&#39;de gösterilen miktarlar kullanılarak su hedef Eımerıa türü özel LF ve LB. </li><li> Kısaca vorteks sonra, astar çözüm karıştırmak mikrofuge&#39;de darbe ve gerekli kadar dondurma. </li></ol></li><li> Her Eimeria türleri tahlil edilmesi için bir lamba reaksiyon MasterMix hazırlayın. Örneklerin sayısına göre Tablo 3&#39;te gösterilen miktarlar çarpın ve bir pozitif kontrol, bir negatif kontrol ve pipetleme yedek için üç ekleyin. 0.5 veya 1.5 ml pipet flip-top mikrosantrifüj tüp. </li></ol> 3. Eimeria LAMBA Testi <ol><li> Pipet 23 ul Eimeria türe özgü Bst DNA polimeraz / LAMP bir 0&#39;a içine MASTERMIX.5 ml mikrosantrifüj tüpü. </li><li> 25 ul bir son reaksiyon hacmini hale (Bölüm 1 &#39;de hazırlandı) 2 ul DNA şablonu ekleyin. </li><li> Bir reaksiyonda (pozitif kontrol) 2 ul Eimeria türe özel genomik DNA ekleyin. Reaksiyonun (negatif kontrol) 2 ul moleküler sınıf su ilave edilir. NOT: Bu tür özel genomik DNA, mevcut değilse, bir önceki pozitif lamba ya da standart PCR ürünü, bunun yerine kullanılabilir. </li><li> 30 dakika boyunca 62 C &#39;de bir su banyosunda ya da ısıtma bloğu içinde inkübe edin. Reaksiyon hemen okumak olacak değilse İsteğe bağlı, 10 dakika boyunca 80 o C ısıtılarak Bst DNA polimeraz de-aktive. </li></ol> 4. LAMP Testi Okuma-out <ol><li> Inkübasyon bitiminde kapalı ışık altında gözle her reaksiyonun rengini değerlendirmek. Negatif sonuçlar, olumlu sonuçlar gökyüzü 20 mavi görünür renkli menekşe pembe görünür. </li><li> İsteğe bağlı olarak, bir Laborat içinde lamba tahlil sonucunu teyit1 x Trıs / borat / EDTA (TBE) tampon maddesi içinde bir% 2 agaroz jel kullanılarak Agaroz jel elektroforez için 1 ul DNA, jel yükleme tampon maddesi ile 5 ul LAMP reaksiyonu ürünü karıştırarak Ory (5 ul başına bir nükleik asit leke kullanılarak önceden boyanmış 50 mi agaroz). Fragman boyutu hesaplama izin jel 1 şeritli bir 1Kb moleküler boyutta DNA merdiveni 5 ul ekleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Chapman, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+review+of+advances+in+coccidiosis+research.">A selective review of advances in coccidiosis research.</a> Adv Parasitol. 83, 93-171 (2013).</li><li>Shirley, M. W., Smith, A. L., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+avian+Eimeria+with+an+emphasis+on+their+control+by+vaccination.">The biology of avian Eimeria with an emphasis on their control by vaccination.</a> Adv Parasitol. 60, 285-330 (2005).</li><li>Fornace, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Eimeria+species+parasites+on+small-scale+commercial+chicken+farms+in+Africa+and+indication+of+economic+profitability.">Occurrence of Eimeria species parasites on small-scale commercial chicken farms in Africa and indication of economic profitability.</a> PLoS ONE. 8 (12), e84254 (2013).</li><li>Schwarz, R. S., Jenkins, M. C., Klopp, S., Miska, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+Eimeria+spp.+populations+in+relation+to+performance+levels+of+broiler+chicken+farms+in+Arkansas+and+North+Carolina.">Genomic analysis of Eimeria spp. populations in relation to performance levels of broiler chicken farms in Arkansas and North Carolina.</a> J Parasitol. 95 (4), 871-880 (2009).</li><li>Peek, H. W., Landman, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coccidiosis+in+poultry:+anticoccidial+products,+vaccines+and+other+prevention+strategies.">Coccidiosis in poultry: anticoccidial products, vaccines and other prevention strategies.</a> Vet Q. 31 (3), 143-161 (2011).</li><li>Johnson, J., Reid, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticoccidial+drugs:+lesion+scoring+techniques+in+battery+and+floor-pen+experiments+with+chickens.">Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens.</a> Exp Parasitol. 28 (1), 30-36 (1970).</li><li>Haug, A., Gjevre, A. G., Skjerve, E., Kaldhusdal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+economic+impact+of+subclinical+Eimeria+infections+in+broiler+chickens+in+Norway.">A survey of the economic impact of subclinical Eimeria infections in broiler chickens in Norway.</a> Avian Pathol. 37 (3), 333-341 (2008).</li><li>Procunier, J., Fernando, M., Barta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+strain+differentiation+of+Eimeria+spp.+of+the+domestic+fowl+using+DNA+polymorphisms+amplified+by+arbitrary+primers.">Species and strain differentiation of Eimeria spp. of the domestic fowl using DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers.</a> Parasitology Research. 79 (2), 98-102 (1993).</li><li>Schnitzler, B. E., Thebo, P. L., Mattsson, J. G., Tomley, F. M., Shirley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+diagnostic+PCR+assay+for+the+detection+and+discrimination+of+four+pathogenic+Eimeria+species+of+the+chicken.">Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenic Eimeria species of the chicken.</a> Avian Pathol. 27 (5), 490-497 (1998).</li><li>Vrba, V., Blake, D. P., Poplstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+assays+for+detection+and+quantification+of+all+seven+Eimeria+species+that+infect+the+chicken.">Quantitative real-time PCR assays for detection and quantification of all seven Eimeria species that infect the chicken.</a> Vet Parasitol. 174 (3-4), 183-190 (2010).</li><li>Morris, G. M., Gasser, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+advances+in+the+diagnosis+of+avian+coccidiosis+and+the+analysis+of+genetic+variation+in+Eimeria.">Biotechnological advances in the diagnosis of avian coccidiosis and the analysis of genetic variation in Eimeria.</a> Biotechnol Adv. 24 (6), 590-603 (2006).</li><li>Perry, B., Randolph, T., McDermott, J., Sones, K., Thornton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Investing in animal health research to alleviate poverty. , (2002).</li><li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers).">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers).</a> Mol Cell Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), E63 (2000).</li><li>Kaneko, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+enterotoxigenic+Clostridium+perfringens+in+meat+samples+by+using+molecular+methods.">Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples by using molecular methods.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7526-7532 (2011).</li><li>Karanis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+preliminary+evaluation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+for+sensitive+detection+of+cryptosporidium+oocysts+in+fecal+and+water+samples.">Development and preliminary evaluation of a loop-mediated isothermal amplification procedure for sensitive detection of cryptosporidium oocysts in fecal and water samples.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (17), 5660-5662 (2007).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Infectious+bursal+disease+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+assay.">Rapid detection of Infectious bursal disease virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay.</a> J Vet Diagn Invest. 21 (6), 841-843 (2009).</li><li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+assays+for+the+species-specific+detection+of+Eimeria+that+infect+chickens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> BMC Vet Res. 7 (1), 67 (2011).</li><li>Long, P., Joyner, L., Millard, B., Norton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+laboratory+techniques+used+in+the+study+and+diagnosis+of+avian+coccidiosis.">A guide to laboratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis.</a> Folia Veterinaria Latina. 6 (3), 201-217 (1976).</li><li>Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+using+hydroxy+naphthol+blue.">Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue.</a> BioTechniques. 46 (3), 167-172 (2009).</li><li>Arakawa, A., Baba, E., Fukata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+tenella+infection+enhances+Salmonella+typhimurium+infection+in+chickens.">Eimeria tenella infection enhances Salmonella typhimurium infection in chickens.</a> Poult Sci. 60 (10), 2203-2209 (1981).</li><li>Blake, D. P., Smith, A. L., Shirley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+fragment+length+polymorphism+analyses+of+Eimeria+spp.:+an+improved+process+for+genetic+studies+of+recombinant+parasites.">Amplified fragment length polymorphism analyses of Eimeria spp.: an improved process for genetic studies of recombinant parasites.</a> Parasitol Res. 90 (6), 473-475 (2003).</li><li>Lund, M., Nordentoft, S., Pedersen, K., Madsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Campylobacter+spp.+in+chicken+fecal+samples+by+real-time+PCR.">Detection of Campylobacter spp. in chicken fecal samples by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 42 (11), 5125-5132 (2004).</li><li>Raj, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR-based+quantification+of+Eimeria+genomes:+a+method+to+outweigh+underestimation+of+genome+numbers+due+to+PCR+inhibition.">Real-time PCR-based quantification of Eimeria genomes: a method to outweigh underestimation of genome numbers due to PCR inhibition.</a> Avian Pathol. 42 (4), 304-308 (2013).</li><li>Blake, D. P., Hesketh, P., Archer, A., Shirley, M. W., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eimeria+maxima:+the+influence+of+host+genotype+on+parasite+reproduction+as+revealed+by+quantitative+real-time+PCR.">Eimeria maxima: the influence of host genotype on parasite reproduction as revealed by quantitative real-time PCR.</a> Int J Parasitol. 36 (1), 97-105 (2006).</li><li>Beck, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+diversity+of+populations+of+apicomplexan+parasites.">Molecular approaches to diversity of populations of apicomplexan parasites.</a> Int J Parasitol. 39 (2), 175-189 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

The Eimeria species-specific LAMP assays described in this paper offer a new diagnostic tool kit in support of effective control of coccidia and the disease coccidiosis. The outcomes of eimerian infection can include severe economic loss as well as seriously compromised bird welfare and increased susceptibility to colonisation by zoonotic pathogens21. Opportunities to monitor flocks for the occurrence of some, or all Eimeria species can provide early warning of a breakdown in anticoccidial control efficacy. Key advantages of LAMP include robust target specificity, resulting from the requirement for six different DNA sequence targets, as well as high sensitivity, boosted by the inclusion of loop primers13, although the qualitative, not quantitative nature of LAMP may be considered a limitation. It is not currently possible to discriminate low level parasite escape from routine chemoprophylaxis or live vaccine replication from unchecked eimerian replication. Nonetheless, the technical ease of the protocol and definitive readout offers considerable improvement over the existing specialist and frequently subjective pathology- and morphology-led approaches6,7. Each assay may be completed at a cost of ~&#163;0.75 per sample, independent of labour and equipment set up expenses. Thus, LAMP assays are also more cost effective than other molecular diagnostics such as PCR, since they require an isothermal incubation with no need for specialist equipment. 
For many years access to Eimeria genomic DNA as template has limited the development and application of molecular field diagnostics. The oocyst is the most readily accessible phase of the eimerian lifecycle, but routine DNA extraction requires laboratory facilities22. Other, more labile intestinal lifecycle stages require purification prior to DNA preparation to prevent PCR inhibition and a consequent loss of sensitivity23,24. The ability to extract eimerian DNA of a quality suitable for LAMP using equipment no more specialised than a microcentrifuge and a water bath, supplemented by inhibitor adsorption using chelex resin, now promotes the wider use of molecular biology in eimerian diagnostics. Intriguingly, the reported detection of quantitative PCR-measurable Eimeria DNA in intestinal tissue 20 days after the initiation of parasite infection, 11 days after the last detectable oocyst output, raises the suggestion that LAMP may be used to detect resolved parasite exposure as well as ongoing infection, even after any visible lesions may have been resolved25. 
The relatively low cost and low technical requirements of LAMP Eimeria diagnostics can promote their application in the developing world where other more established approaches may not be available or appropriate. For this to be applicable each assay must be capable of detecting all strains which may be circulating within each region. While understanding of the genetic diversity prevailing among Eimeria species is limited26, the use of target sequences previously validated for use in quantitative PCR with strains from Africa, Asia, Europe and South America provides some evidence of conservation, supporting the utility of these LAMP assays around the world10.

Küresel tavuk üretimi gelişmekte olan dünyada gelişmiş ülkelerde tanık yaklaşık dört kat genişleme barındırma on kat üzerinde son 50 yıldır arttı <a href="http://www.faostat.org">(www.faostat.org)</a> . Dünya gıda güvenliği tavuk üretiminin önemi büyüdü kadar çok tavuklarda ciddi hastalığa neden olabilir patojenlerin profiline sahiptir. Bir örnektir enterik hastalık koksidiyoz 1 neden olabilir Eimeria türleri, her yerde protozoon parazitler vardır. Tavuk yetiştirilen her yerde, bir ya da daha fazla Eimeria türleri 2-4 yaygın olması muhtemeldir. Gelişmiş dünyada Eimeria öncelikle direnç 5 etkisini en aza indirmek için servis veya rotasyon programları kullanılarak, kemoprofilaksi tarafından kontrol edilir. Canlı aşılar da kuş değeri elde etme maliyeti haklı göstermek için yeterli olduğu sistemlerde kullanılır (örneğin, stok, katmanları ve bazı piliç 5 damızlık). Bir resu olarakKlinik coccidiosis genellikle iyi kontrol edilir, bu önlemlerin lt, sub-klinik enfeksiyon 5 yaygın olmasına rağmen. Gelişen dünya aşılama nadirdir ve ilaç uygulaması sık sık az iyi bilgilendirilmiş. Sonuç olarak-sub klinik ve klinik coccidiosis daha yaygındır ve önemli bir ekonomik etkisi 3 uygular. En yaygın olarak kullanılan skorlama sistemi bile yazarlar, bazı türler için &quot;böyle bir prosedür herhangi fakat orta şiddetli enfeksiyonlarda denenmelidir şüphelidir görünüyor&quot; yorumunu rağmen eimerian enfeksiyon tanısı geleneksel, otopsiyi puanlama lezyon dayandığı 6. Morfolojisi örtüşen uzman 6,7 ama bulandırabilir rağmen Ek delil, dışkı veya çöp örneklerinde çevre dirençli Ookist yaşam döngüsü aşamasında mikroskobik algılama yoluyla elde edilebilir. Polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak moleküler alternatifler (PCR) kullanılarak, rasgele amplificatiopolimorfik DNA PCR (RAPD-PCR) ve kantitatif PCR teknolojileri n 20 yıla kadar 8-10 mevcut olmuştur, ancak bugüne kadar popüler hale başarısız olmuştur. Bağıl gider ve uzman laboratuar ekipmanları veya işleme gereksinimi genellikle subjektif ve teknik olarak zor yaşlı pathology- doğası ve mikroskopi tabanlı 10,11 yaklaşımlar rağmen, kendi alımını sınırlıdır. Bu tür sınırlamalar yoksulluk üzerindeki koksidiyoz etkisi 12 orantılı büyük olabilir gibi Güney Doğu Asya gibi dünyanın yoksul bölgelerinde, birçok abartılı olabilir. Buna karşılık, Eimeria türe özgü teşhis deneyleri, yeni basit ve hassas, ancak maliyeti etkin bir açık bir talep var. Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), büyük bir DNA miktarlarda büyütme yeteneğine sahip bir DNA polimerazı güdümlü bir yöntem hazırlamak çok kolaydır. En önemlisi, LAMP bir Bst DNA polymera kullanırse yerine termal çevrim 13,14 için gerek olmaksızın, tek bir sabit sıcaklıkta, DNA amplifikasyonu kolaylaştıran genel olarak PCR&#39;de kullanılan Taq DNA polimerazı. LAMBA bile en ilkel laboratuvarda veya sahada uygulama için uygun olabilir. Birçok PCR inhibitörleri, yüksek duyarlılık ve özgünlüğü göre direnç ile karakterize, LAMP deneyleri enfeksiyöz bursa hastalığı virüsü, Clostridium perfringens ve Cryptosporidium 15-17 olmak üzere patojenlerin geniş bir yelpazede geliştirilmiştir. Buna karşılık tavuk enfekte yedi Eimeria türlerinin her özel LAMP tahliller panel 18 geliştirilmiştir yeni maliyet-etkin Eimeria türe özgü teşhis için talep. Yeni tahliller için başvurular böyle kötü ekonomik pe ile Eimeria maxima veya Eimeria necatrix gibi türlerin derneği verilen belirli değerin izlenmesi parazit oluşumunu içerir3,4 rformance. Diğer uygulamalar çiftlik antikoksidiyal stratejisi, sub-klinik enfeksiyon veya klinik hastalık ve bir çiftlik Eimeria yarattığı riskin değerlendirilmesi tanı etkinliğini değerlendirmek içerir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:295px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">RNAlater</td>
			<td style="width:161px;">Ambion</td>
			<td style="width:139px;">AM7024</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Ethanol</td>
			<td style="width:161px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:139px;">20821.321</td>
			<td style="width:295px;">Caution, highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">100 x Tris-EDTA (TE) buffer concentrate</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T9285</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Chelex 100 resin</td>
			<td style="width:161px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">142-1253</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Molecular grade water</td>
			<td style="width:161px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:139px;">10977035</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. acervulina F3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. acervulina B3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. acervulina FIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. acervulina BIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. acervulina LB</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*TAAGGTTACACCCGTGGAGG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. acervulina LF</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GCCATGCACAAAGCGACTT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. brunetti F3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GGCCATCAAGTTCCATGAGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. brunetti B3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. brunetti FIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. brunetti BIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. brunetti LB</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GAAACGCTCGAACATGGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. brunetti LF</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. maxima F3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. maxima B3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. maxima FIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA 
			AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. maxima BIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. maxima LB</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CAAGCCTACGCGGACATC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. maxima LF</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*TTATGCAGCTGGGTCAACG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. mitis F3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. mitis B3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. mitis FIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT 
			AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. mitis BIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA 
			GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. mitis LB</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*TCCATGCATCCCCTTGTT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. mitis LF</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CGTGGGCACAGATTGATTC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. necatrix F3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*TGGCTTTCCCGCGTACC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. necatrix B3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CGGCCCAACACAAAGACTG</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. necatrix FIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA 
			CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. necatrix BIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. necatrix LB</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. necatrix LF</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GAACAGCCGGAGCCTCTC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. praecox F3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. praecox B3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GCGCACGAATCTGAATCACAC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. praecox FIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT 
			A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. praecox BIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. praecox LB</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GAATAGCATTGCCAGGTGG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. praecox LF</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GTCCACTGTCATTAATATTGC 
			TGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. tenella F3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. tenella B3</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GCTGAGTCCATACGTACTTCCT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. tenella FIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC 
			AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. tenella BIP</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA 
			GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">E. tenella LB</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CGCATGTGCAGTTGAAGACA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">E. tenella LF</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">VC00021</td>
			<td style="width:295px;">*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA 
			TTAACAAG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">10 x ThermoPol reaction buffer</td>
			<td style="width:161px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">B9004S</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:295px;">MgSO4</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">M7506</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">dNTPs</td>
			<td style="width:161px;">Promega</td>
			<td style="width:139px;">U1330</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Betaine solution (5 M)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">B0300</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Bst polymerase</td>
			<td style="width:161px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">M0275S</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Hydroxynaphthol blue</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">33936</td>
			<td style="width:295px;">Dissolved in molecular grade water.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">UltraPure agarose</td>
			<td style="width:161px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:139px;">16500-500</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">10 x Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer</td>
			<td style="width:161px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:139px;">AM9863</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Blue/Orange DNA loading dye (x6)</td>
			<td style="width:161px;">Promega</td>
			<td style="width:139px;">G1881</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">GeneRuler 1Kb DNA ladder</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">SM0313</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SafeView nucleic acid stain</td>
			<td style="width:161px;">NBS Biologicals</td>
			<td style="width:139px;">NBS-SV</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loop-mediated isothermal amplification (lamp) assays for the species-specific detection of eimeria that infect chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Tahlil doğrulama Doğrulama esnasında, her Eimeria türe özgü lamba deney, bir ana kontrol olarak tavuk, hem de tavuk genomik DNA enfekte yedi Eimeria türü temsil saf DNA örnekleri oluşan bir panel kullanılarak test edilir. Agaroz jel elektroforezi her deney çözmek için kullanılan ve herhangi bir ana çapraz reaksiyon 18 mutlak türlere göre gösterilmiştir. Daha sonra, bir on misli seri seyreltme serileri genomik DNA, bir ila on genom kopyalarının 18&#39;in bir deney hassasiyet limiti ortaya saflaştırılmış Eimeria tenella kullanılarak hazırlandı. Üst sınır yok, en yüksek konsantrasyon (100.000 genom kopya) 18 olmak üzere pozitif kadar elde edilen sonuçlara ve tespit edilmiştir. Alan örnekleri ile Uygulama Eimeria testleri için alınan örnekler p bir sonucu olarak itlaf ölü bulundu tavuklardan elde edilmesi olasıdıroor sağlık ya da bir ila üç olası örneklem büyüklüğü gösteren, sentinel sağlık gözetimi için itlaf zaman rutin bir parçası. Bir gözetim programının bir parçası olarak ABD broyler çiftliği toplanan üç kuş Test bağırsak örneklerinin üç set vermiştir. Her Eimeria türleri (Tablo 1) için tercih edilen bir bağırsak sitesi öncelik, türe özgü lamba deneyleri uygulanmasını hedefleyen bir göstergesi olarak mavi hydroxynaphthol (Şekil 2A) ile test edilen tüm kuşlarda eimerian enfeksiyonun görsel tespitine olanak tanıdı. hydroxynaphthol mavi kullanırken olumsuz LAMP reaksiyonu ile elde rengi pembe mor arasında değişir, ama her zaman pozitif bir sonuç elde mavi ayrıdır yapabilirsiniz. Agaroz jel elektroforezi ile teyit benzer sonuçlar (Şekil 2B) elde edilmiştir. Alan uygulaması sırasında kullanıcı yedi türlere karşı tam ekran uygulamak için tercih, ya da öncelik yalnızca türlerin hedefleyebilirÖnemli veya bilinen çiftlikte dolaşan veya çevredeki edilecek. Eimeria oluşumu herhangi bir yeni test basitlik ihtiyacını vurgular için PCR-temelli yaklaşımların yetersizliği teşhisi olarak benimsenmesi. LAMP PCR daha basit hazırlık ve işleme sunarken, kuş başına birden fazla bağırsak sitelerini test etmek şartı kırıcı kalır. Bir veya daha fazla lamba tahlilleri ile test edilebilir kuş başına tek havuza DNA örneği, üretimi, daha çekici olması muhtemeldir. Her bağırsak Alanı ayrı ayrı işlendi olduğu gibi aynı sonucu (Şekil 2, yedi lamba deneyleri ile test edilmesi için, Tablo 1 &#39;de tarif edilen DNA hazırlanmadan önce bir araya getirilmiş özel bağırsak sitelerinin yolunun her birinden toplanan malzemesini temsil eden, kuş başına bir araya getirilmiş numune Resim işleme ) Şekil 3 ile karşılaştırıldığında. <img alt="Şekil 1," src=&quot;/files/ftp_upload/52552/52552fig1.jpg&quot; /&gt; Tavuk bulaştırmak Eimeria tür parazitlerin LAMP tespiti için Şekil 1. Bağırsak örnekleme siteleri. Her Eimeria türlerinin hedeflenen bağırsak bölgeleri E. (noktalı siyah çizgiler arasındaki sayısına göre belirtilen örnekleme tercih siteleri ile, renkli çizgilerle vurgulanır acervulina: Sarı / 1, E. brunetti: pembe / 2, E. maxima: mavi / 3, E. mitis: kırmızı / 5, E. praecox: turuncu / 4 E. necatrix yeşil / 6 ve E. tenella: gri / 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52552/52552fig2.jpg" /> Eimerian enfeksiyon Şekil 2. LAMBA tanı froBir gök mavisi tepki olumlu oldu ve pembe reaksiyona mor negatif oldu, ve (B) agaroz jel elektroforezi burada m, üç ticari etlik tavuk. LAMBA reaksiyonları, (A) kullanarak mavi hydroxynaphthol çözüldü. örneklenmiş bağırsak siteler gibi her parazit türleri için Tablo 1&#39;de gösterilmiştir. A = E acervulina, B = E. brunetti, Ma = E. maksimum Mi = E. mitis, N = E. necatrix, p = E. praecox ve T = E. tenella. Şerit 1 GeneRuler 1Kb DNA merdiveni içeriyordu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52552/52552fig3.jpg" /> Eimerian enfeksiyon Şekil 3. LAMP tanı üç ayrı ticari etlik tavuk örnekleri toplanmış kullanarak. LAMBA REACları bir gök mavisi tepki olumlu oldu ve pembe reaksiyona menekşe negatif hydroxynaphthol mavi kullanılarak çözüldü. A = E acervulina, B = E. brunetti, Ma = E. maksimum Mi = E. mitis, N = E. necatrix, p = E. praecox ve T = E. tenella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Örnek sitesi </td><td> Eimeria türleri tahlil (büyük olasılıkla) </td></tr><tr><td> Duodenal (D) </td><td> E acervulina, E. praecox </td></tr><tr><td> Jejunum / ileum * (J / I) </td><td> E maxima, E. necatrix </td></tr><tr><td> Çekumu (C) </td><td> E. necatrix, E. tenella </td></tr><tr><td> Terminal ileum (TI) </td><td> E. brunetti, E mitis </td></tr&gt; <tr><td> Bir araya toplanan numune (P) </td><td> E acervulina, E. brunetti, E maxima, E mitis, E. necatrix, E. praecox, E tenella </td></tr></tbody></table> Aday Eimeria türleri deneyleri Tablo 1. Bağırsak bölgeye özgü bir seçim. Bölgelerin seçimi, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi her bir Eımerıa turu için değişir numune için. Toplanmış örnek daha sonra DNA hazırlanması için bir araya getirilmiş dört özel sitelerde toplanan malzeme içerir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Astar * </td><td> Hazır konsantrasyonu (uM) </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Su </td><td> - </td><td> 60 </td></tr><tr><td> İleri İç Astar (FIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Geriye İç Primer (BIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> İleri Dış Astar (F3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Geriye Dış Astar (B3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Döngü İleri (LF) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Geriye Döngü (LB) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td></td><td> 200 </td></tr></tbody></table> LAMP astar ön karışımın Tablo 2. Hazırlık. LAMP için bir astar ön karışım hazırlamak için gerekli bileşenleri ve oranlar. Gösterilen Ciltler 100 LAMBA reaksiyonlar içindir. * Malzeme gösterildiği gibi Astar kimlikleri Barkway ark (2011) 18. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Stok kons n </td><td> Nihai reaksiyon kons n </td><td> Reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> DDW </td><td> - </td><td> - </td><td> 10.1 </td></tr><tr><td> ThermoPol tampon </td><td> 10 x </td><td> 1 x </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 100 mM </td><td> 2 mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Primer karışımı * </td><td colspan="2"> Tablo 2 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> 25 mM </td><td> 400 um </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Betain </td><td> 5M </td><td> 1M </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Hydroxynaphthol mavi </td><td> 3mM </td><td> 120 uM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Bst DNA polimerazı </td><td> 8000 U / ml </td><td> 8 U </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td></td><td></td><td> 23 </td></tr></tbody></table> Bir LAM Tablo 3. HazırlıkP reaksiyon masterkarışım. * Eimeria türe özgü.

Watch this Scientific Journal Video about Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens at JoVE.com

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller<em&gt; Eimeria</em&gt; Tavuklar bulaştırmak ki

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Bulaştırmak için bir protokol<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ile<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...