Name: forward genetics screens using macrophages to identify toxoplasma gondii genes important for resistance to ifn-&#947;-dependent cell autonomous immunity
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃŽÂ³-Dependent Cell Autonomous Immunity at JoVE

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

HINWEIS: Alle Protokolle, die die Verwendung von Tieren beteiligt wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der New York Medical College der Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt. HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die chemische Mutagenese 38, Isolierung von Parasiten durch Grenzverdünnung 38, Isolierung von murinen Knochenmark-Makrophagen 39, das Wachstum von T. gondii in humanen Vorhaut-Fibroblasten (HFF) Zellen und Zysten i...

Die beschriebenen Protokoll stellt eine nicht voreingenommen Ansatz, der die Aktivierung von Maus-Knochenmark stammenden Makrophagen und zukunfts Genetik T. isolieren verwendet gondii-Mutanten mit Defekt in der Fähigkeit, die Aktivierung von infizierten Makrophagen zu überleben. Der Phänotyp der Mutanten nach Makrophagenaktivierung fällt in der Regel in eine von zwei Kategorien: 1) Die Parasiten scheinen intakt, aber nicht über den 1. Parasiten pro PV replizieren; 2) Die Parasiten erscheinen abgeb...

Toxoplasma gondii (T. gondii) ist ein obligat intrazelluläre, Protozoen-Erreger. Es ist der Erreger der Toxoplasmose, ein Gesundheitsrisiko bei immungeschwächten Individuen. Es ist auch das Modellsystem für andere apicomplexan Krankheitserreger, die Menschen, einschließlich Cryptosporidium und Cyclospora infizieren. Toxoplasmose ist am häufigsten durch den Verzehr von Nahrung oder Wasser mit dem bradyzoite oder Oozysten Stadium des Parasiten verunreinigt erworben. Nach der Einnahme konvertieren diese Stufen auf die Tachyzoiten Stadium des Parasiten, die in Wirtszellen repliziert und verbreitet systemisch. T-Zellen, IFN-γ und, in geringerem Maße, Stickstoffmonoxid 1-4, sind wichtig für die Kontrolle der Infektion jedoch nicht zur Eliminierung der Erkrankung, als Anteil der Tachyzoiten umwandeln zum bradyzoite Stufe, die innerhalb Gewebezysten geschützt was zu einem langlebigen chronischen Infektion. In der Tat gibt es keine wirksame Therapie gegen die chronische Zyste sTage der Erkrankung. Schwere Toxoplasmose ist meist durch die Reaktivierung der persistierenden Infektion mit dem bradyzoite Stadium des Parasiten Konvertierung zurück in die schnell zu replizieren Tachyzoiten Phase charakteristisch für primäre und akute Infektion. Frühe Überleben angesichts der angeborenen Immunantwort ist wichtig, damit der Parasit, genügend Parasitenzahlen zu erreichen, sowie distalen Stellen zu erreichen, für die Niederlassung einer chronischen Infektion zu ermöglichen. T. gondii hat Strategien zur Wirtsabwehrmechanismen, die wahrscheinlich ihre Fähigkeit zu replizieren und Verbreitung der Infektion früh beitragen entgegenzuwirken entwickelt. Zuerst T. gondii bildet eine einzigartige PV bei Parasitenbefall weitgehend getrennt von den endozytischen und Exozytose-Prozesse der Wirtszelle im Vergleich zu anderen intrazellulären Pathogenen 5-9 ist. Auch, wie alle erfolgreichen intrazelluläre Erreger T. gondii modifiziert seine Wirtszelle, um einen permissiven Umgebung f erstellenoder Wachstum. Dies beinhaltet eine Anpassung Wirtszelle Genexpression durch Veränderung Wirtszelle Transkriptionsfaktoren einschließlich der wichtig für die Regulierung Zellaktivierung 10-15. ROP16 16-19 GRA15 20. GRA16 21 und GRA24 22 erwiesen sich alle als bei der Regulierung der Transkriptionsreaktion und Zellsignalkaskaden von Wirtszellen mit T. infiziert wichtig gondii. Jüngste Studien mit genetischen Kreuzungen zwischen Parasitenstämme mit unterschiedlichen Phänotypen sehr produktiv bei der Identifizierung von Genen, die Parasiten Parasiten Genotyp-abhängigen Eigenschaften einschließlich Umgehung der Immunität GTPasen (IRGs) 16,19,23-26 zugrunde liegen gewesen. In Mäusen sind Immunität GTPasen (IRGs) kritisch für die Steuerung der Typ II und III Genotypen des Parasiten während der sehr virulenten Typ I Genotypen Mechanismen entwickelt, um die murinen IRGs entziehen. Es ist aber auch klar, dass der Parasit hat Mechanismen entwickelt, um antimikrobielle Medien umgehenren neben den IRGs und dass einige dieser Mechanismen können für Parasiten Genotypen 27,28 konserviert werden. Zudem ist sehr wenig über den kritischen Mediatoren der Zell autonome Immunität gegen T. bekannt gondii während menschliche Toxoplasmose. Parasite Gene wichtig für die Resistenz gegen Vermittler von Zell autonome Immunität kann auch überlebenswichtig sein, während Tachyzoiten Umwandlung, die auch von Wirtsimmunreaktionen ausgelöst werden können, um bradyzoite. So kann beispielsweise Stickstoffmonoxid auf hohem Niveau Parasitenreplikation in infizierten Makrophagen unterdrücken, aber es kann auch dazu anregen Tachyzoiten zu Umrechnung in Zyste Produktion 30-32 bradyzoite. ToxoDB ist eine funktionelle Genomdatenbank für T. gondii, der als wichtige Ressource für das Feld in Bezug auf die Bereitstellung Sequenzinformation für die Parasitengenom und den Zugang zu veröffentlichten und nicht veröffentlichten genomischen Maßstab Daten einschließlich Community Anmerkungen Gen exp<html> ression und Proteomik-Daten 33. Ähnlich wie bei vielen Protozoen- Pathogene, der Großteil des Genoms besteht aus hypothetischen Gene ohne von Informationen aus Genhomologie Einblick in ihre möglichen Funktionen bereitzustellen. So ist nach vorn Genetik ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Parasiten Gene wichtig für Immunevasion, Zyste Umwandlung und andere Funktionen entscheidend für Parasiten Pathogenese als auch für die Konvertierung zwischen verschiedenen Entwicklungsstadien zu identifizieren. Eine weitere Stärke der Vorwärtsgenetik ist, dass es als ein relativ nicht-vorgespannten Ansatz verwendet, um den Parasit zu den Genen, die für spezifische Aufgaben in Pathogenese, einschließlich Immunumgehung und Zystenbildung sind abzufragen. Die jüngsten Verbesserungen in Next Generation Sequencing für Mutationsprofiling haben sie eine Methode der Wahl für die Identifizierung der verantwortlichen Parasiten Gene von vorn Genetik Studien unter Verwendung von chemischen und Insertionsmutagenese 34-37 hergestellt. ntent &quot;&gt; Es ist wichtig, um Schwachstellen in T. gondii, die ausgenutzt werden, um die Wirksamkeit der Zell autonomen Immunmechanismen gegen den Parasiten insbesondere solche, die auch gegen die resistenten Zyste Bühne aktiv sein können. Um dieses Ziel zu, ein in vitro-Mäuse zu verbessern identifizieren Makrophageninfektion und Aktivierungsmodell wurde entwickelt, um Mutationen in die Parasiten, insbesondere T. gondii Fitness nach Aktivierung der infizierten Makrophagen, aber nicht in naiven Makrophagen limitieren. Dieses Makrophagen Bildschirm verwendet, um eine Bibliothek von T. gondii Insertionsmutanten um abzufragen letztendlich identifizieren T. gondii wichtige Gene für die Resistenz gegen Stickoxid 27,28. Die Isolierung von einem Panel von T. gondii-Mutanten mit verminderter Widerstandsfähigkeit gegenüber der Aktivierung der infizierten Makrophagen, insbesondere eine ausgeprägte Empfindlichkeit gegenüber Stickstoffmonoxid, erwies sich die Nützlichkeit des Screening zur Identifizierung Parasiten Gene wichtig für WiderstandMediatoren der Zell autonome Immunität mit Ausnahme der für die murine IRGs 28 beschriebenen Resistenzmechanismen. Insertionsmutagenese hat Vorteile gegenüber chemischen Mutagenese im Hinblick auf die Erzeugung einer begrenzten Anzahl von zufälligen Mutationen in jeder Parasit Klons und theoretisch eine leichtere Identifizierung der Mutationsstelle. Die Identifizierung der Genom-Stelle des Plasmids Insertion in T. gondii Insertionsmutanten in der Praxis hat sich überraschend schwierig, in vielen Fällen 37. Einführen eines Plasmids in einem Gen ist auch geeignet, die Funktion eines Gens, das im Gegensatz zur chemischen Mutagenese, die typischerweise zu einzelnen Nucleotidänderungen stören. Die chemische Mutagenese mit entweder N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU) oder Ethylmethansulfonat (EMS) zu einer erhöhten Fähigkeit, einen größeren Teil des Parasitengenoms zu analysieren bieten, im Vergleich zu Insertionsmutagenese, da sie mehrfache Punktmutationen erzeugt ( geschätzt bei 10 -100) pro Mutante 34, 38. Außerdem jüngsten Fortschritte in der gesamten Genoms Profilierung hat es möglich gemacht, um der nächsten Generation Sequenzierung verwenden, um die wahrscheinlichsten Kandidaten-Gene für die identifizierte Phänotyp eines mutierten Parasiten 34,38 verantwortlich sind. Unabhängig von der Mutagenese-Ansatz, Bestätigung der Rolle von dem Parasiten Gen der Resistenz gegen Makrophagenaktivierung erfordert letztendlich Gendeletion und Komplementation zu molekularer Koch-Postulate zu erfüllen. Die Fähigkeit, die Funktion eines Gens durch genetische Manipulation sowohl des Parasiten und dem Makrophagen zergliedern ist wichtig, da viele der über Vorwärts Genetik in T. identifizierten Gene gondii, wie auch andere Krankheitserreger, werden noch als hypothetische Gene mit wenig bis keine Sequenzhomologie zu anderen Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. Die aktuelle Papier einen allgemeinen Ansatz, der verwendet werden kann, um zu ermitteln, ob die unterbrochene Gen in einer Mutante ist wichtig für den Widerstand gegen eine bekannte oder umreißtunbekannt Vermittler von Zell autonome Immunität. Die erste Analyse der Host antimikrobielle Faktoren wird durch die Auswertung der Überlebensrate von Wildtyp und Mutante Parasiten in Makrophagen, die von Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu denen mit spezifischen Gendeletionen in induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), gp-91 phox (NADPH-Oxidase) durchgeführt wird, und spezifische Immunität GTPasen (IRGs). Damit wird festgelegt, ob die identifizierten Parasiten Gene sind wichtig für die Resistenz gegen Stickstoffmonoxid, reaktive Sauerstoffzwischenprodukte oder Immunität GTPasen bzw. 28 oder wenn ein unbekannter Immunsystems beteiligt ist. Aktivierung der infizierten Makrophagen sowohl IFN-γ und LPS in der aktuellen Protokoll beschrieben, resultiert in erster Linie bei der Isolierung von Parasitengene wichtig für die Resistenz gegen Stickstoffoxid 28. Die Verwendung von pharmakologischen Mitteln, die Stickstoffmonoxid in Abwesenheit von Makrophagen-Aktivierung zu induzieren (Stickoxiddonoren) bestätigte, dass die Mehrheit der identifizierten Gene, die für Wieder warenWiderstand gegen Stickstoffmonoxid anstatt Stickoxid zusammen mit weiteren Mediatoren mit Makrophagenaktivierung 28 verbunden. Schritt eins und zwei beschreiben eine Vorwärtsgenetik Bildschirm entworfen, um Parasiten Mutanten mit einem Fitness-Defekt nach der Aktivierung von infizierten Knochenmark-Makrophagen in vitro zu isolieren. Schritt eins beschreibt eine Dosistitration Analyse empirisch bestimmen eine Dosis von IFN-γ und LPS für Makrophagenaktivierung, die Parasiten Replikation reduziert, aber nicht vollständig hemmen die Replikation von Wildtyp T. verwenden gondii Elternstamm, die für die Erstellung der Bibliothek des Parasiten Mutanten verwendet wird. Schritt zwei wird die Vorwärts genetischen Screening der Mutanten-Klone in Makrophagen in 96-Well-Platten. Schritt drei beschreibt einen Ansatz, um den Phänotyp jeder Mutante in dem Bildschirm der 96-Well-Platten identifiziert und zu bewerten, ob der Fehler in jeder Mutante wirkt das Überleben der Parasiten, die Replikation zu bestätigen,oder Zysten Produktion als Antwort auf die Makrophagenaktivierung. Schritt vier wird die Verwendung von Knochenmark-Makrophagen von Mäusen mit Deletionen in spezifischen antimikrobiellen Wege um die Immunmediatoren, auf die der Parasit Mutante spezifisch empfindlich identifizieren. Schritt fünf beschreibt einen Ansatz, um zu bestimmen, ob ein Parasit Mutante ist auch für in vivo Pathogenese beeinträchtigt, wie durch Zystenproduktion in den Gehirnen von infizierten Mäusen ausgewertet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">Name of the material</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalog number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008101</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29101&#38;productId=3255471&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone FBS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=11737973&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone DPBS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3002802&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2434305&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType 
			=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone L-glutamine</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3003401&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3311957&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType 
			=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Pen strep</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SV30010&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&#38;productId=1309668 
			6&#38;catalogId=29104&#38;matchedCat 
			No=SV30010&#38;fromSearch=1&#38; 
			searchKey=SV30010&#38;highlightPro 
			ductsItemsFlag=Y&#38;endecaSearch 
			Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&#38;xrefPartType=From&#38;savings= 0.0&#38;xrefEvent=1407777949003_0 
			&#38;searchType=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Hanks BSS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3003002</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3064595&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS</td>
			<td>LIST biologicals</td>
			<td align="right">201</td>
			<td>http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&#38;product_id=81&#38;keywords 
			=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN-g</td>
			<td>Pepro Tech Inc</td>
			<td>50-813-664</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail=&#39;item&#39;&#38;storeId=10652&#38; 
			productId=2988494&#38;catalogId=29 
			104&#38;matchedCatNo=50813664&#38; 
			fromSearch=1&#38;searchKey=murine+ifn+pepro+tech&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&#38;xrefPartType=From&#38;savings 
			=0.0&#38;xrefEvent=1407778210608_ 
			12&#38;searchType=PROD&#38;hasPromo 
			=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td align="right">177402</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2164545&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well optical plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td align="right">165306</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3010670&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td align="right">353072</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3158736&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flast T25</td>
			<td></td>
			<td align="right">156367</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&#38;productId=127039 
			67&#38;catalogId=29104&#38;matchedCat 
			No=12565351&#38;fromSearch=1&#38; 
			searchKey=156367&#38;highlightProdu 
			ctsItemsFlag=Y&#38;endecaSearchQu 
			ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&#38;xrefPartType=From&#38;savings 
			=0.0&#38;xrefEvent=1407778974800_ 
			0&#38;searchType=PROD&#38;hasPromo 
			=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Ted Pella EM grade formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td align="right">18505</td>
			<td>http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3425922&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 - protein conjugation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20181</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat serum</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19135680</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2133236&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;crossRefData 
			=ICN19135680=2&#38;searchType 
			=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H1200</td>
			<td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-conjugated dolichos</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FL-1031</td>
			<td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody to LAMP1</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-7526</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td align="right">664</td>
			<td>http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gp91 phox knock out mice</td>
			<td>Jackson Labaoratories</td>
			<td align="right">2365</td>
			<td>http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iNOS knock out mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td align="right">2609</td>
			<td>http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium nitroprusside</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>AC21164-0250&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2627727&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DETA NONOate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>AC32865-0250</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2252389&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab</td>
			<td></td>
			<td>10T19A</td>
			<td>http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetics screens using macrophages to identify toxoplasma gondii genes important for resistance to ifn-&#947;-dependent cell autonomous immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Toxoplasma gondii repliziert frei in naiven Makrophagen und weist eine Verdopplungszeit von 6-12 h in Abhängigkeit von der Belastung des Parasiten. Abbildung 1 zeigt repräsentative Parasiten in naiven Vergleich aktiviert Knochenmark stammenden Makrophagen. Abbildung 2 zeigt die allgemeine Morphologie des Parasiten in HFF Wirtszellen, die nach 2, 4, 8, 16 und 32 Parasiten / PV. In der gegenwärtigen Protokoll wird der Parasit darf naiv Makrophagen eindringen und stellen Sie ei...

Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃŽÂ³-Dependent Cell Autonomous Immunity at JoVE

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Unit 2

Population Genetics

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Gewinnung von hochgradig gereinigter Toxoplasma gondii Oocysten durch eine diskontinuierliche Cäsiumchloridgradienten

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...