Name: forward genetics screens using macrophages to identify toxoplasma gondii genes important for resistance to ifn-&#947;-dependent cell autonomous immunity
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃŽÂ³-Dependent Cell Autonomous Immunity at JoVE

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

참고 : 동물의 사용을 포함 모든 프로토콜 뉴욕 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 참고 : 희석 (38), 쥐의 골수 유래 대 식세포 (39)의 분리, T.의 성장을 제한함으로써 화학 돌연변이 (38), 기생충의 분리를위한 상세한 프로토콜 인간의 포피 섬유 아세포에서 포자충 (HFF) 대 식세포의 세포와 낭종 생산 및 ?...

설명 된 프로토콜은 뮤린 골수 유래 대 식세포를 분리 T. 순방향 유전학의 활성화를 사용하여 비 편파 접근법을 제공 자신의 능력에 결함이와 포자충 돌연변이 감염된 대 식세포의 활성화를 생존. 돌연변이 다음 식세포 활성화의 표현형은 일반적으로 두 가지 범주 중 하나에 해당 : 1) 기생충은 그대로 나타나지만 PV 당 1 기생을 넘어 복제하는 데 실패; 2) 기생충이 저하 될 넓고...

톡소 포자충 (T. 포자충)는 의무적 인 세포, 원 충성 병원체이다. 이 톡소 플라즈마 증의 원인균, 면역 개인의 건강 위험이 있습니다. 또한 포자충과 원 포자충 속을 포함하여 인간을 감염 다른 apicomplexan 병원균의 모델 시스템입니다. 톡소 플라즈마 증은 가장 일반적으로 기생충의 bradyzoite 또는 oocyst 단계에 오염 된 음식이나 물을 섭취을 통해 획득된다. 섭취시,이 단계는 숙주 세포 내에서 복제하고 체계적으로 유포 기생충의 tachyzoite 단계로 변환합니다. T 세포, IFN-γ와, 낮은 정도, 산화 질소 1-4, 감염의 조절에 중요하지만 tachyzoites의 비율로, 병을 제거 할 수없는 조직 포낭 내에서 보호된다 bradyzoite 스테이지로 변환 수명이 긴 만성 감염의 결과. 사실, 어떤 치료제는 만성 낭종의에 효과가없는질병의 다케. 심한 톡소 플라즈마 증은 기본 및 급성 감염의 신속 복제 tachyzoite 단계 특성으로 다시 변환 기생충의 bradyzoite 단계로 인해 지속적인 감염의 재 활성화에 가장 많다. 선천성 면역 반응의면에서 이른 생존 기생충 충분한 기생충 번호에 도달 할뿐만 아니라 만성 감염의 확립을 가능하게하기 위해, 말초 부위에 도달 할 수 있도록하는 것이 중요하다. T. 포자충 가능성 복제 및 감염의 조기 보급 할 수있는 능력에 기여하는 숙주 방어 메커니즘을 방해하는 전략을 진화했다. 첫째, T. 포자충 다른 세포 내 병원체에 비해 5-9 숙주 세포 내 이입 및 exocytic 프로세스와 크게 편석 기생충 침윤 동안 고유 PV를 형성한다. 또한, 모든 성공적인 세포 내 병원균의 T. 같은 포자충은 f를 허용 환경을 조성하기 위해 숙주 세포를 수정또는 성장. 이것은 세포 활성화 10-15 조절에 중요 포함한 숙주 세포 전사 인자를 변경하여 재 프로그래밍 숙주 세포의 유전자 발현을 포함한다. ROP16 16-19 GRA15 20 GRA16 21, 22는 모두 GRA24 T. 감염된 숙주 세포를 전사 캐스케이드 반응을 조절하고 세포 시그널링에 중요한 것으로 밝혀졌다 포자충. 별개의 표현형과 기생충 변종 사이의 유전 십자가를 사용하여 최근의 연구는 면역 관련 GTP 아제 (IRGs) 16,19,23-26의 회피를 포함하여 기생충 유전자형에 의존하는 특성을 기초 기생충 유전자를 식별하는 매우 생산되고있다. 매우 독성이 강한 유형 I 유전자형이 쥐 IRGs을 회피 메커니즘을 진화하는 동안 마우스에 면역 관련 GTP 아제 (IRGs)는 유형 II의 제어 및 기생충의 III 유전자형을 위해 중요하다. 그러나, 기생충 항균 미디어를 회피하는 메커니즘을 진화 한 것이 분명하다이러한 메커니즘의 일부 IRGs과 그 외에 TORS는 기생충 유전자형 (27, 28)에 걸쳐 보존 할 수있다. 또한, 약간은 T.에 대한 세포 자율 면역의 중요한 매개체에 대해 알려진 인간의 톡소 플라즈마 증 동안 포자충. tachyzoite 또한 호스트 면역 반응에 의해 유발 될 수있는 변환을 bradyzoite하는 동안 셀 자율 면역 매개 물질에 대한 저항성에 중요한 기생충 유전자는 생존을 위해 중요 할 수있다. 예를 들어, 높은 수준의 질소 산화물이 감염된 대 식세포 기생충 복제를 억제 할뿐만 아니라 생산 낭종 30-32 변환을 초래하는 bradyzoite tachyzoite을 자극 할 수있다. ToxoDB는 T.위한 기능 게놈 데이터베이스입니다 포자충 그 지역 사회 주석을 포함한 출판되지 않은 게놈 규모의 데이터 시퀀스 기생충 게놈에 대한 정보와 액세스를 제공하는 측면에서 필드의 중요한 자원으로 기능, 유전자 특급<html> ression 및 단백체 데이터 (33). 많은 충성 병원체와 마찬가지로, 게놈의 대부분이 잠재적 인 기능에 대한 통찰력을 제공하기 위해 유전자 상 동성을 기반으로 사용할 수없는 정보와 가상의 유전자로 구성되어 있습니다. 따라서, 앞으로 유전자는 면역 회피, 낭종 변환 및 기생충 병인뿐만 아니라 별개의 발달 단계 사이의 변환을위한 중요한 다른 기능에 중요한 새로운 기생충 유전자를 식별 할 수있는 강력한 도구입니다. 순방향 유전학의 추가적인 장점은 면역 회피 및 포낭 형성 포함한 병인 특정 작업에 중요한 유전자로 기생충 심문 비교적 비 편향된 방식으로 사용될 수 있다는 점이다. 돌연변이 프로파일 링을위한 차세대 시퀀싱 최근 개선은 화학에서 삽입 모두 돌연변이 유발 34 ~ 37를 사용하여 앞으로 유전학 연구의 책임 기생충 유전자를 식별하기위한 선택의 방법을 만들었습니다. ntent은 &quot;&gt; 그것은 특히 또한 저항 낭종 단계에 활성화 될 수 것들.이 목표를 향해, 시험관 쥐의 기생충에 대한 세포 자율 면역 메커니즘의 효율성을 향상시키기 위해 이용 될 수있다 T. 포자충의 취약점을 파악하는 것이 중요하다 대 식세포 감염 및 활성화 모델을 구체적으로 순진한 대 식세포에 감염된 대 식세포의 활성화가 아닌 다음 T.의 포자충 체력을 손상 기생충 돌연변이를 확인하기 위해 개발되었다.이 대 식세포 화면에 순서대로 T. 포자충에서 삽입 돌연변이 체의 라이브러리를 심문하기 위해 사용되었다 궁극적으로 산화 질소 (27, 28)에 대한 내성을 위해 중요 T. 포자충 유전자를 확인한다. 감염된 대 식세포 산화 질소 특히 현저한 감도의 활성화에 장애가 저항 T. 포자충 돌연변이 패널의 분리를 식별하기 위해 화면의 유용성을 입증 저항에 대한 중요한 기생충 유전자뮤린 IRGs 28에 기재된 저항기구 이외 셀 자율 면역 매개체이다. 삽입 성 돌연변이 유발 이론 랜덤 기생충 각 클론의 돌연변이 및 돌연변이의 위치의 식별을 용이하게 제한된 수를 생성하는 관점에서 화학적 돌연변이 유발에 비해 많은 장점을 갖는다. 그러나, T.에서 플라스미드 삽입의 게놈 사이트를 식별합니다 포자충 삽입 성 변이체는, 실제로는, 많은 경우에 37 의외로 어려웠다. 유전자 내로 플라스미드의 삽입은 일반적으로 단일 염기 변화를 초래 화학적 돌연변이 대조적으로 유전자의 기능을 방해하기 쉽다. 그것은 다수의 단일 염기 다형성을 생성하지만, 화학적 돌연변이 유발 N 에틸 -N- 니트로 소 우레아 (ENU) 또는 ethylmethane 설포 네이트 (EMS) 중 하나와 (삽입 성 돌연변이 유발에 비해 기생충 게놈의 큰 부분을 분석 할 수있는 증가 된 능력을 제공 할 수있다 돌연변이 (34) 당 10 -100)로 추정38. 또한, 전체 게놈 프로파일 최근 발전은 가능한 돌연변이 기생충 34,38의 표현형에 책임 식별 가능성의 후보 유전자를 동정하는 차세대 시퀀싱을 사용하도록했다. 상관없이 돌연변이 유발 접근법 식세포 활성화에 저항 기생충 유전자의 역할을 확인 궁극적 분자 코흐의 공리를 충족 유전자 결실 및 보완이 필요하다. 기생충 및 대식구 모두의 유전자 조작에 의한 유전자의 기능을 절개하는 능력은 T. 앞으로 유전학 통해 식별 된 유전자의 많은만큼 중요 포자충,뿐만 아니라 다른 병원체는 아직 공지 기능없이 다른 단백질 서열 상 동성이 거의 가설 유전자로 특징 지어진다. 현재 용지는 돌연변이 유전자의 파괴는 공지 또는 내성에 중요한 것인지 식별​​ 할 수있는 일반적인 방법을 설명셀 자율 면역 알 수없는 중재자. 숙주 미생물 인자 초기 분석은 야생형 및 유도 성 산화 질소 합성 효소 (iNOS의) GP-91 phox (NADPH 옥시 다제)에서 특정 유전자의 결실로 그 대 야생형 마우스에서 대 식세포의 돌연변이 기생충의 생존을 평가함으로써 수행되고 특정 면역 관련 GTP 아제 (IRGs). 확인 된 기생충 유전자가 산화 질소, 활성 산소 중간체 또는 면역 관련 GTP 아제 (28)을 각각 또는 알 수없는 면역 메커니즘이 관련된 경우에 대한 저항성에 중요한 경우를 결정합니다. 현재의 프로토콜에 기재된 IFN-γ와 LPS 모두 감염된 대 식세포의 활성화는, 주로 일산화 질소 (28)의 저항에 중요한 기생충 유전자의 분리 결과. 마크로파지 활성화의 부재 하에서 산화 질소 유도되는 약물의 사용은 (산화 질소 공여체) 식별 유전자의 대부분이 재 중요한 것이 확인산화 질소보다는 대 식세포 활성화 (28)와 관련된 추가 매개과 콘서트에서 산화 질소에 sistance. 하나, 둘, 시험관에 감염된 골수 유래 대 식세포의 활성화를 다음과 피트니스 결함과 기생충 돌연변이를 분리하기위한 앞으로 유전학 화면을 설명하는 단계. 하나 기생충 복제를 감소 시키지만, 완전 야생형 T.의 복제를 저해하지 않는 대 식세포 활성화를 위해 사용 된 실험적 IFN- γ와 LPS의 투여 량을 결정하기 위해 용량 적정 분석을 설명 스텝 기생충 돌연변이 라이브러리의 제작에 사용되는 모 균주 포자충. 두 번째 단계는 96 웰 플레이트에서 대 식세포의 돌연변이 클론의 앞으로 유전 화면을 설명합니다. 세 번째 단계는 각 돌연변이에 결함이 기생충의 생존에 영향을 미치는지, 복제를 평가하고 96 웰 플레이트의 화면에서 식별 된 각 돌연변이의 표현형을 확인하는 방법을 설명,대 식세포의 활성화에 응답 또는 낭종 생산. 네 단계는 돌연변이 기생충은 특히 민감되는 면역 매개체를 식별하기 위해 특정 항균 통로에 결실 된 마우스 골수 유래 대 식세포를 사용하는 방법을 설명한다. 5 단계는 감염된 쥐의 뇌에 낭종 생산에 의해 평가 등의 기생충 돌연변이는 또한 생체 기전에 대한 손상 여부를 확인하는 방법을 설명합니다.

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			<td>Vector Labs</td>
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		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetics screens using macrophages to identify toxoplasma gondii genes important for resistance to ifn-&#947;-dependent cell autonomous immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

톡소 포자충은 순진 대 식세포에서 자유롭게 복제하고 6 ~ 12 시간이 기생충의 변형에 따라 사이에 두 배의 시간이 있습니다. (1)가 활성화 된 골수 유래 대 식세포 대 순진한 대표 기생충을 보여줍니다. 그림 2 HFF에서 기생충의 일반적인 형태를 보여줍니다 2, 4, 8, 16, 32 기생충 / PV에서 숙주 세포. 현재 프로토콜에서 기생충은 순진 대 식세포 침입 감염된 대 식세포에 ...

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Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

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Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Unit 2

Population Genetics

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

고도 정화 구하기 Toxoplasma gondii</em불연속 세슘 클로라이드 그라디언트로> Oocysts

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

연구

면역학 및 감염병학

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

활성 골수 - 유래 Macrophages과 Bradyzoite Toxoplasma gondii 약관의 낭종의 벽 형성

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

선정 Plasmodium falciparum</em인간 두뇌 내피 세포 Cytoadhesion위한> 기생충

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

앞으로 유전 접근<em&gt; 클라미디아의 trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...