Name: forward genetics screens using macrophages to identify toxoplasma gondii genes important for resistance to ifn-&#947;-dependent cell autonomous immunity
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃŽÂ³-Dependent Cell Autonomous Immunity at JoVE

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

MERK: Alle protokoller som innebærer bruk av dyr ble utført i samsvar med de retningslinjer og bestemmelser fastsatt av New York Medical College Animal Care og bruk komité. Merk: Detaljert protokoller for kjemisk mutagenese 38, isolering av parasitter ved begrensende fortynning 38, isolering av muse-benmargsmakrofager avledet 39, veksten av T. gondii i menneskelig forhuden fibroblast (HFF) celler og cyste produksjon i makrofager og grunnleggende immunofluorescensanalys...

Den beskrevne protokoll gir en ikke-forspent tilnærming som benytter aktivering av murine benmargsmakrofager og termin genetikk å isolere T. gondii mutanter med en defekt i deres evne til å overleve aktivering av infiserte makrofager. Fenotypen av mutanter følgende makrofagaktivering faller vanligvis inn i en av to kategorier: 1) De parasitter vises intakt, men mislykkes i å replikere utover en parasitt per PV; 2) Parasittene vises degradert og kan være i romslige, amorfe musikkvideoer. Det faktum at muta...

Toxoplasma gondii (T. gondii) er en obligat intracellulær, protozo- patogen. Det er den utløsende agent for toksoplasmose, en helsefare i immunsupprimerte individer. Det er også modellsystemet for andre apicomplexan patogener som infiserer mennesker inkludert Cryptosporidium og Cyclospora. Toksoplasmose er oftest ervervet gjennom inntak av mat eller vann som er forurenset med bradyzoite eller oocyst stadiet av parasitten. Ved inntak, disse stadiene konvertere til tachyzoite stadiet av parasitten som reproduserer innenfor vertsceller og formidler systemisk. T-celler, IFN-γ og, i mindre grad, nitrogenoksid 1-4, er viktige for kontroll av infeksjon, men er ikke i stand til å eliminere sykdommen, som en andel av tachyzoites konvertere til bradyzoite trinn som er beskyttet innenfor vev cyster resulterer i en langlivet kronisk infeksjon. Faktisk er det ingen therapeutics effektiv mot kronisk cyste stage av sykdommen. Alvorlig toksoplasmose er som oftest på grunn av reaktivering av vedvarende infeksjon, med bradyzoite stadium av parasitten omdannelse tilbake til den hurtig replikerende tachyzoite stadium karakteristisk for primær og akutt infeksjon. Tidlig overlevelse i ansiktet på den medfødte immunrespons er viktig for å tillate at parasitten å nå tilstrekkelig parasitt tall, samt for å nå fjerntliggende områder, for å muliggjøre etablering av kronisk infeksjon. T. gondii har utviklet seg strategier for å motvirke vertsforsvarsmekanismer som sannsynligvis bidrar til dens evne til å replikere og spre tidlig i infeksjonen. Først, T. gondii danner et unikt PV under parasitt invasjon som i stor grad er adskilt fra de endocytiske og exocytic prosesser av vertscellen i forhold til andre intracellulære patogener 5-9. Også, i likhet med all vellykket intracellulære patogener T. gondii modifiserer sin vertscelle for å skape en ettergivende miljø feller vekst. Dette inkluderer omprogrammering vertscelle genuttrykk ved å endre vertscelle transkripsjonsfaktorer, inkludert de viktige for å regulere celleaktivering 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, GRA16 21 og GRA24 22 har alle blitt vist å være viktige i reguleringen av transkripsjonen respons og cellesignaleringskaskader vertsceller infisert med T. gondii. Nyere studier ved hjelp av genetiske krysser mellom parasitt stammer med forskjellige fenotyper har vært svært produktiv i å identifisere parasitt gener som ligger til grunn parasitt genotype avhengige egenskaper inkludert unndragelse av immunitetsrelaterte GTPases (IRGs) 16,19,23-26. Hos mus, immunitetsrelaterte GTPases (IRGs) er kritisk for kontroll av type II og III genotyper av parasitten mens svært virulente type jeg genotyper har utviklet mekanismer for å unngå de murine IRGs. Men det er også klart at parasitten har utviklet mekanismer for å unngå antimikrobiell mediatorer i tillegg til de IRGs og at noen av disse mekanismene kan bevares på tvers parasitt genotyper 27,28. I tillegg, er meget lite kjent om de kritiske mediatorer av celleautonome immunitet mot T. gondii under human toksoplasmose. Parasitt gener viktige for motstand mot meklere av celle autonome immunitet kan også være viktig for å overleve under tachyzoite å bradyzoite konvertering som også kan utløses av vertsimmunresponser. For eksempel kan nitrogenoksid ved høye nivåer undertrykke parasittreplikasjon i infiserte makrofager, men det kan også stimulere tachyzoite å bradyzoite omdannelse resulterer i produksjon cyste 30-32. ToxoDB er en funksjonell genomisk database for T. gondii som fungerer som en kritisk ressurs for feltet i form av å gi sekvensinformasjon for parasitten genomet og tilgang til publiserte og upubliserte genomisk skala data inkludert samfunnet merknader, genet exp<html> ression og proteomikk data 33. I likhet med mange protozo patogener, flertallet av genomet består av hypotetiske gener med ingen informasjon er tilgjengelig basert på genet homologi for å gi innsikt i deres potensielle funksjoner. Således er termin genetikk et kraftig verktøy for å identifisere nye parasitt gener som er viktige for immunsvik, cyste omdannelse og andre funksjoner kritiske for parasitt patogenesen samt for omdannelse mellom forskjellige utviklingsstadier. En ekstra styrke av termin genetikk er at den kan brukes som en relativt ikke-partisk tilnærming å avhøre parasitten som til de gener som er viktige for spesifikke oppgaver i patogenesen, inkludert immununndragelser og cyste formasjon. Nylige forbedringer i neste generasjons sekvensering for mutasjons profilering har gjort det en metode for valg for å identifisere de ansvarlige parasitt gener fra termin genetiske studier ved hjelp av både kjemisk og insertional mutagenese 34-37. ntent &quot;&gt; Det er viktig å identifisere sårbarheter i T. gondii som kan utnyttes for å forbedre effektiviteten av cellestyrte immunmekanismer mot parasitten spesielt de som kan også være aktiv mot resistente cyste scenen. Mot dette målet, en in vitro murine makrofag-infeksjon og aktivering modell ble utviklet for å identifisere mutasjoner i parasitten som spesifikt svekker T. gondii kondisjon etter aktivering av infiserte makrofager, men ikke i naive makrofager. Denne makrofag-skjermen ble brukt til å avhøre et bibliotek av T. gondii insertional mutanter for å til slutt T. gondii identifisere gener som er viktige for resistens mot nitrogenoksid 27,28. Isoleringen av et panel av T. gondii-mutanter med redusert motstand mot aktivering av infiserte makrofager, spesielt en markert sensitivitet overfor nitrogenoksid, viste anvendeligheten av skjermen for å identifisere parasitt gener viktige for motstandtil meklere av celle autonome immunitet annet enn resistensmekanismer som er beskrevet for de murine IRGs 28. Insertional mutagenese har fordeler fremfor kjemisk mutagenese når det gjelder å generere et begrenset antall tilfeldige mutasjoner i hver parasitt klone og i teorien enklere identifisering av stedet for mutasjon. Men å identifisere den genomiske sete av plasmid innsetting i T. gondii insertional mutanter, i praksis, har vært overraskende vanskelig i mange tilfeller 37. Innsetting av et plasmid inn i et gen er også sannsynlig å forstyrre funksjonen av et gen i motsetning til kjemisk mutagenese, som vanligvis resulterer i enkle nukleotid-endringer. Imidlertid kjemisk mutagenese med enten N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller etylmetansulfonat (EMS) kan gi en øket evne til å analysere en større del av parasitten genomet, sammenlignet med insertional mutagenese, som det skaper flere enkelt-nukleotid polymorfismer ( anslått til 10 -100) per mutant 34, 38. Dessuten har nylige fremskritt i hele genomet profilering gjort det mulig å bruke neste generasjon sekvensering for å identifisere de mest sannsynlige kandidat gener som er ansvarlige for den identifiserte fenotypen av en mutert parasitt 34,38. Uavhengig av mutagenese tilnærming, bekreftelse av rollen til parasitten genet i motstand mot makrofagaktivering slutt krever genet delesjon og komplemente å oppfylle molekyl Koch postulater. Evnen til å dissekere funksjonen av et gen ved genetisk manipulering av både parasitten og makrofag er viktig da mange av de gener som er identifisert via termingenetikk T. gondii, så vel som andre patogener, er fortsatt karakterisert som hypotetiske gener med liten eller ingen sekvenshomologi med andre proteiner med kjente funksjoner. Den nåværende papir skisserer en generell metode som kan brukes til å identifisere hvorvidt forstyrret genet i en mutant som er viktig for motstanden til en kjent ellerukjent formidler av celle autonome immunitet. Den første analyse av verts antimikrobielle faktorer utføres ved evaluering av overlevelsen av villtype og mutante parasitter i makrofager fra mus av villtype versus de med spesielle gendelesjoner i induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS), gp-91 phox (NADPH oksidase), og spesifikk immunitet relatert GTPases (IRGs). Dette vil avgjøre om de identifiserte parasitt gener er viktige for motstand mot nitrogenoksid, reaktive oksygenmellom eller immunitetsrelaterte GTPases 28 henholdsvis eller hvis en ukjent immunsystemet er involvert. Aktivering av infiserte makrofager med både IFN-γ og LPS, som er beskrevet i den aktuelle protokoll, resulterer primært i isolering av parasitt-gener som er viktige for motstand mot nitrogenoksid 28. Bruken av farmakologiske midler som induserer nitrogenoksid i fravær av makrofagaktivering (nitrogenoksiddonorer) bekreftet at flertallet av de gener som er identifisert var viktig for gjenmotstandsevne til nitrogenoksid i stedet for nitrogenoksid i konsert med flere meglere tilknyttet makrofagaktivering 28. Trinn en og to beskrive en fremover genetikk skjermen er utformet for å isolere parasitt mutanter med trenings defekt som følge av aktivering av infiserte benmarg-avledede makrofager in vitro. Trinn man beskriver en dosetitrering analyse for å empirisk å bestemme en dose av IFN-γ og LPS til bruk for makrofagaktivering som reduserer parasittreplikasjon, men ikke fullt inhiberer replikasjon av villtype T. gondii foreldrestamme som brukes for opprettelse av biblioteket av parasitt-mutanter. Trinn to beskriver videre genetisk skjermen av de mutante kloner i makrofager i 96-brønners plater. Trinn tre skisserer en tilnærming for å bekrefte fenotype av hver mutant identifisert i skjermen av de 96 brønners plater og å vurdere om feilen i hver mutant påvirker parasitt overlevelse, replikering,eller cyste produksjon som respons makrofagaktivering. Trinn fire beskriver bruk av benmarg-avledede makrofager fra mus med delesjoner i bestemte antimikrobielle veier å identifisere de immunmediatorer som parasitten mutanten er spesielt utsatt. Trinn fem skisserer en tilnærming for å avgjøre om en parasitt mutant er også kompromittert for in vivo patogenesen som vurderes av cyste produksjon i hjernen hos infiserte mus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">Name of the material</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalog number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008101</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29101&#38;productId=3255471&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone FBS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=11737973&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone DPBS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3002802&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2434305&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType 
			=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone L-glutamine</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3003401&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3311957&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType 
			=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Pen strep</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SV30010&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&#38;productId=1309668 
			6&#38;catalogId=29104&#38;matchedCat 
			No=SV30010&#38;fromSearch=1&#38; 
			searchKey=SV30010&#38;highlightPro 
			ductsItemsFlag=Y&#38;endecaSearch 
			Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&#38;xrefPartType=From&#38;savings= 0.0&#38;xrefEvent=1407777949003_0 
			&#38;searchType=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Hanks BSS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH3003002</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3064595&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS</td>
			<td>LIST biologicals</td>
			<td align="right">201</td>
			<td>http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&#38;product_id=81&#38;keywords 
			=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN-g</td>
			<td>Pepro Tech Inc</td>
			<td>50-813-664</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail=&#39;item&#39;&#38;storeId=10652&#38; 
			productId=2988494&#38;catalogId=29 
			104&#38;matchedCatNo=50813664&#38; 
			fromSearch=1&#38;searchKey=murine+ifn+pepro+tech&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&#38;xrefPartType=From&#38;savings 
			=0.0&#38;xrefEvent=1407778210608_ 
			12&#38;searchType=PROD&#38;hasPromo 
			=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td align="right">177402</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2164545&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well optical plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td align="right">165306</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3010670&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td align="right">353072</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3158736&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flast T25</td>
			<td></td>
			<td align="right">156367</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&#38;productId=127039 
			67&#38;catalogId=29104&#38;matchedCat 
			No=12565351&#38;fromSearch=1&#38; 
			searchKey=156367&#38;highlightProdu 
			ctsItemsFlag=Y&#38;endecaSearchQu 
			ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&#38;xrefPartType=From&#38;savings 
			=0.0&#38;xrefEvent=1407778974800_ 
			0&#38;searchType=PROD&#38;hasPromo 
			=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Ted Pella EM grade formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td align="right">18505</td>
			<td>http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=3425922&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 - protein conjugation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20181</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat serum</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19135680</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2133236&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;crossRefData 
			=ICN19135680=2&#38;searchType 
			=PROD&#38;hasPromo=0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H1200</td>
			<td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-conjugated dolichos</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FL-1031</td>
			<td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody to LAMP1</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-7526</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td align="right">664</td>
			<td>http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gp91 phox knock out mice</td>
			<td>Jackson Labaoratories</td>
			<td align="right">2365</td>
			<td>http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iNOS knock out mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td align="right">2609</td>
			<td>http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium nitroprusside</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>AC21164-0250&#160;</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2627727&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DETA NONOate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>AC32865-0250</td>
			<td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&#38;langId=-1&#38;catalog 
			Id=29104&#38;productId=2252389&#38;dis 
			type=0&#38;highlightProductsItemsFlag 
			=Y&#38;fromSearch=1&#38;searchType= 
			PROD&#38;hasPromo=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab</td>
			<td></td>
			<td>10T19A</td>
			<td>http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetics screens using macrophages to identify toxoplasma gondii genes important for resistance to ifn-&#947;-dependent cell autonomous immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Toxoplasma gondii replikerer fritt i naive makrofager og har en dobling tid mellom 6-12 timer avhengig av belastningen av parasitten. Figur 1 viser representative parasitter i naive versus aktiverte benmargavledede makrofager. Figur 2 viser den generelle morfologi av parasitter i HFF vertsceller ved 2, 4, 8, 16 og 32 parasitter / PV. I den aktuelle protokoll, er parasitten lov til å invadere naive makrofager og etablere en begynnende parasitophorous vakuole (PV) forut for leve...

Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃŽÂ³-Dependent Cell Autonomous Immunity at JoVE

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Genetics vinduene ved hjelp Makrofager å identifisere<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gener Viktig for Resistance til IFN-γ-Dependent Cell Autonomous immunitet

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Unit 2

Population Genetics

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Valg av Plasmodium falciparum Parasitter for Cytoadhesion til Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En Screeningsteknikken å isolere Toxoplasma gondii Host-celle Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk manipulering i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer for Funksjonell genom analyse av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetiske tilnærminger i<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Ved hjelp av RNA-interferens for å undersøke det medfødte immunrespons i Musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...