Name: mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis
Uploaded: 2015-03-31T15:00:00
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We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

참고 : 모든 제브라 피쉬의 연구와 동물의 유지 보수는 메이요 클리닉 연구소 IACUC 승인 프로토콜 # A41213에 맞게 시행 하였다. Transgenesis 1. DNA를 구축 <ol><li> DNA 서식 파일로 (BACPAC 자원 센터 (BPRC)에서) CH211-270H11 BAC 클론을 사용하여 5.2 kb의 도파민 베타 수산화 (D βh) 프로모터 영역 (8)을 증폭. 2 분 94 ° C (94 ° C, 15 초, 50 ° C, 10주기 30 초, 68 ° : 긴 DNA 템플릿의 길?...

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

이 대표 연구에서는이 유전자가 현저히 화합물 안정적인 형질 전환 어류 coexpressing에서 우리의 이전 연구 결과와 일치하는 신경 모세포종의 발병을 가속화하기 위해 협력 것을 보여주기 위해 유전자 변형 물고기를 발현 MYCN의 mCherry 리포터 유전자로 과도 공사 출 활성화 ALK의 동시 발현을 사용 모두 ALK와 MYCN 8 활성화. 이 형질 전환 방법은 모자이크 종래 방법에 ...

암은 시간이 지남에 병리학 적 돌연변이, 삭제 및 염색체 이익의 축적에 의해 표시 진보적 인 질병이다. 이러한 유전 적 이상이 저산소증과 같은 스트레스 반응 세포 골격의 세포주기, 세포 사멸, 에너지 대사 및 조립에 이르기까지 다수의 세포 과정에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 종양은 생물학적 과정의 스펙트럼에 걸쳐 여러 유전 수차의 집단 행동을 반영한다. 전체 게놈 시퀀싱, 진유 전체 시퀀싱, 타겟 시퀀싱, 깊은 시퀀싱 및 게놈 넓은 협회 연구 등을 포함하여 통합 게놈 연구 노력은, 종양 1-4 본질적으로 모든 종류의 새로운 유전 적 변화의 증가를 확인했다. 많은 경우에, 유전 적 병변은 질병의 발병 기전에서의 협력을 제안, 랜덤하지 않은 방식 5-8에서 함께 발생합니다. F를 결과 비정상적으로 발현 유전자의 큰 배열의 발암 역할을 해부이러한 게놈 병변 ROM 새로운 치료 전략을 고안하고 이러한 에이전트에 종양 세포의 반응을 이해할 필요가 있지만, 이것은 높은 처리량 기능적 게놈 분석의 수행에 대해 매우 강력한 동물 모델 시스템을 필요 곤란한 과제를 증명했다 생체. 포유 동물, 특히 쥐가 암 생물학에서 선호하는 모델이지만, 제브라 피쉬는 상당한 관심을 끌기 시작했다. 경골 제브라 피쉬 (다리오 레 리오 (rerio))는 1960 년대 이후 개발 연구를위한 모델 생물로 사용되었으며, 1982 9-11 종양 발병 기전의 연구에 적용 하였다. 유지 보수, 작은 몸 크기, 높은 생산력의 용이성 제브라 피쉬의 이상과 병리학 적 표현형 (10)을 부여 돌연변이를 확인하는 대규모 앞으로 유전 화면을위한 강력한 모델합니다. 제브라 피쉬 배아의 광학 투명성,이 암 모델의 넓은 사용을 지원하는 또 다른 핵심 기능입니다그것은, 실시간 9 설치류 (12)에 상대적으로 어려운 응용 프로그램을 종양 발생을 찾기 위해 실시하는 생체 내 이미징에 있습니다. 제브라 피쉬 참조 게놈 (Zv9)의 최근 비교 게놈 분석은, 71 %는 82 %가 남자 (OMIM) 데이터베이스 (13)에 온라인 멘델의 상속 질병 관련 유전자와 상관 관계가있는 인간의 orthologues을 갖는, 26,206 단백질 코딩 유전자를 밝혀 (14). 따라서, 제브라 피쉬가 신경 모세포종 (8)을 포함하여 인간의 암의 다양한 유형을 모델링하는 데 사용되었습니다, T 세포 급성 림프 구성 백혈병 (T-ALL) 15, 16, 흑색 종 (17, 18), 유잉 육종 (19), 횡문근 육종 (20, 21), 췌장암 22, 간세포 암 (23)과 골수는 24, 25을 악성 종양, 이종 이식에 대한 암 모델 11,26 연구로 선정되었습니다. 안정적인 형질 전환제브라 피쉬의 접근 방식은 일반적으로 기능 획득 정상적인 발달 또는 질병의 발병 기전 (27, 28)에서 유전자의 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 모델 (도 1a)을 개발하기 위해, 하나의 셀은 하나의 야생형으로 배아 조직 - 특이 적 프로모터에 의해 구동 관심 유전자를 포함하는 DNA 작 제물을 주사. 주입 된 배아는 성적 성숙에 도달하면 세 4 개월 주사 후, 그들은 설립자 물고기로 라이센스를 자신의 생식 세포에 건설 DNA의 통합을 보여주는 것들에 대한 선별 야생 형 물고기와 outcrossed된다. 그러한 카피 수와 트랜스 진의 통합 사이트 등 많은 요소, 안정한 유전자 변형 라인에서의 유전자 발현에 영향을 미친다. 그러므로, 트랜스 제닉 종양 모델을 개발하기 위해, 하나의 종양 유전자를 과발현하는 형질 전환 계통 안정 다중 먼저 생성되고 종양을 유도 이어질 수도 수준에서 트랜스 유전자를 발현하는 라인에 대해 스크리닝 할 수있다. 그러나, 후보 O 과발현ncogene가 생식 세포에 독성이며, 직접 트랜스 29 과발현 형질 전환하여 안정된 선을 생성하는 것이 곤란하다. 따라서, 이러한 접근법은 적절한 암 모델을 생성하기 위해 고장 위험이 높은, 시간 소모적 일 수있다. 여기서 우리는 생체 내에서 기능 게놈 연구에 대한 기존의 안정적인 transgenesis를 통해 독특한 장점을 제공 모자이크 과도 transgenesis (그림 1B)에 따라 다른 전략을 설명한다. 이 방법에서는, 하나 이상의 형질 전환 유전자 구조체는 형질 전환 또는 야생형의 하나의 배아 세포 단계로 주입된다. 유전자를 포함하는 주입 된 DNA 구조는 개별 물고기 (30)의 여러 세포 집단 내에서 혼합 된 유전자형의 결과로, 다음 mosaically 무작위로 차 주입 물고기에 통합되어 있습니다. 또한, 여러 DNA의 공사 출 하나의 세포 배아의 구축은 공동의 통합을 위해 임의의 사이트에서 동일한 셀에, TRA 하나를 허용 리드유전자의 발현과 세포를 CE 및 모자이크 동물 (31)의 질병 발병시 다른 유전자의 상호 작용을 탐구한다. 원리의 증거로서, 우리는 일시적으로 야생 형 물고기와 MYCN 과발현 형질 전환 어류의 도파민 베타 수산화 (D의 βh) 프로모터의 제어하에 주변 교감 신경계 (PSNS)에 mCherry 리포터 유전자와 mutationally 활성화 ALK를 (F1174L) 과발현. 수용체 티로신 키나제를 코딩 ALK는 고위험 신경 모세포종 5-7,32,33에서 가장 빈번하게 돌연변이 된 유전자이다. ALK 가장 빈번한 활성화 및 유력한 체세포 돌연변이 중 하나 (F1174L)은, 표현 위에-IS MYCN- 고위험 신경 모세포종 환자를 증폭하고 안정적인 형질 전환 마우스 및 형질 전환 제브라 피쉬 모델 8,34,35 모두에서 신경 모세포종의 종양 발생을 촉진 MYCN 과발현과 synergizes. 모자이크으로MYCN 유전자 변형 물고기 mCherry와 ALK (F1174L)의 과도 과발현, 우리는 모자이크 transgenesis 전략에 신속하고 효율적으로 사용될 수 있음을 시사 ALK (F1174L) 및 MYCN 모두를 과발현 안정적인 형질 전환 어류에서 관찰 된 종양 발병의 가속도를 효과적으로 요약 생체 내 종양 개시에 여러 개의 종양 유전자의 상대적 기여도를 평가합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Expand Long Template PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td style="width:119px;">11681834001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR-TOPO vector&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:119px;">451641</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td style="width:119px;">M0202M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway LR Clonase II enzyme 
			Mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#174; BP Clonase&#174; II enzyme mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">GC-RICH PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td>12 140 306 001</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Meganuclease I-SceI&#160;</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon digital sight DS-U1 camera</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

mutationally 활성화 ALK의 F1174L 또는 야생형 ALK의 과발현은 신경 모세포종 유도에서 MYCN과 협력 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 MYCN를 과발현하는 형질 전환 어류의 PSNS의 개발 βh 프로모터의 제어하에 활성화 인간의 ALK 또는 야생 형 인간 ALK를 과발현. ALKF1174L 또는 dβh - - 다음과 같은 구조, dβh 중 하나 ALKWT는 dβh와</em...

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

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Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

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Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...