Name: design, surface treatment, cellular plating, and culturing of modular neuronal networks composed of functionally inter-connected circuits
Uploaded: 2015-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le projet BRIANBOW européenne (FP7 Jeunes Explorateurs, Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jacopo Tessadori des commentaires utiles sur le manuscrit, et Silvia Chiappalone pour son aide dans la production des graphiques utilisés dans la vidéo.

La procédure a été fait en conformité avec les normes NIH pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité de Tel-Aviv University animale soin et l&#39;utilisation (nombre de permis - L-14-019). 1. Préparation d&#39;instruments et PDMS <ol><li> Préparer la plaquette (Table des matières, ou commander la plaquette d&#39;un laboratoire de microfabrication), un scalpel, et une paire de pinces à épiler - stérilisation ...

<ol>
	<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+syntax:+cell+assemblies,+synapsembles,+and+readers.">Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers.</a> Neuron. 68, 362-385 (2010).</li><li>Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+and+hierarchically+modular+organization+of+brain+networks.">Modular and hierarchically modular organization of brain networks.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).</li><li>Levy, O., Ziv, N. 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J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+properties+for+biomedical+micro/nanosystems.">Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems.</a> Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).</li><li>Campo, A. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8:+a+photoresist+for+high-aspect-ratio+and+3D+submicron+lithography.">SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography.</a> Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).</li><li>Liu, G. T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kan+Y+Fabrication+of+high-aspect-ratio+microstructures+using+SU8+photoresist.">Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist.</a> Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).</li><li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. 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W., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Fixed-Array+Multi-Microelectrode+System+Designed+for+Long-Term+Monitoring+of+Extracellular+Single+Unit+Neuronal-Activity+In+vitro.">New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro.</a> Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).</li><li>Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+of+spontaneous+activity+with+photoetched+microelectrode+surfaces+from+mouse+spinal+neurons+in+culture.">Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).</li><li>Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. 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J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture.">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab Chip. 9, 404-410 (2009).</li><li>Georger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coplanar+Patterns+of+Self-Assembled+Monolayers+for+Selective+Cell-Adhesion+and+Outgrowth.">Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth.</a> Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).</li><li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture.">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li><li>Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstamp+patterns+of+biomolecules+for+high-resolution+neuronal+networks.">Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 36, 135-141 (1998).</li><li>Petrelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+drop+patterning+for+rapid+on-chip+neuronal+connect-ability+assays.">Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays.</a> Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).</li><li>Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+networks+on+reliable+patterned+substrates.">Hippocampal networks on reliable patterned substrates.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).</li></ol>

Un protocole de croître réseaux neuronaux modulaires 2D in vitro composé de circuits fonctionnellement interconnectés est décrite. La procédure est basée sur un motif sur la couche adhésive cellulaire. Modélisation est réalisé avec PDMS pochoirs reproduire l&#39;aspect négatif de l&#39;architecture de réseau désiré. Pochoirs PDMS définissent les zones où la couche adhésive est déposée cellulaire. Une fois que les cellules sont étalées, ils assemblent spontanément aux îles recouvertes et ...

Preuves expérimentales et théoriques soutiennent la possibilité que le cerveau fonctionne par l&#39;activation coordonnée des agencements de piles 1-5, qui peut être considéré comme unités fonctionnelles dynamiques qui interagissent de façon transitoire avec l&#39;autre, mise en forme et les différents états sous-jacents du cerveau. Modularité fonctionnelle dépend également et associé à l&#39;organisation modulaire de la structure des circuits cérébraux 6,7. Comment la fonction et la structure des circuits cérébraux façonnent mutuellement est encore l&#39;une des principales questions ouvertes en neurosciences. Afin de fournir une meilleure compréhension de cette question, il est important d&#39;identifier les cadres expérimentales optimales où il est possible de répondre, au moins partiellement, ces questions. Depuis contrôlée manipulation de la dynamique spatio-temporelles des réseaux neuronaux dans des expériences in vivo est difficile, le développement de modèles in vitro de réseaux neuronaux est d&#39;un grand intérêt en raison de leur acc facileessibility, la surveillance, la manipulation et la modélisation de 8,9. Au cours des dernières années, dans les technologies appuyées par des méthodes in vitro substrat de modelage avancées ont permis d&#39;induire réseaux neuronaux pour développer une gamme de structures modulaires prédéfinis 3 et d&#39;étudier les propriétés fonctionnelles des réseaux avec des topologies imposées 10. En particulier, les méthodes ont récemment été utilisés pour organiser des réseaux en imposant des contraintes 4,11 physique. En effet, pour étudier le lien entre la structure et la fonction dans les réseaux neuronaux et de fournir une représentation simplifiée mais plausibles d&#39;interagir assemblées de neurones, les systèmes in vitro doivent fournir des sous-populations neuronales interconnectées. 2D cultures neuronales homogènes largement étudiés ne imposent pas de contraintes spatiales sur le câblage des circuits émergente auto-organisée. Par conséquent, une approche possible pour façonner assemblages de cellules interconnectées artificiellement est de positionner différentes populations neuronales dans naissainially zones distinctes. La distance entre ces zones ne empêche pas les assemblées inter connexions. Cette approche, tout en assurant un contrôle considérable sur la complexité du réseau, a été montré pour fournir un répertoire plus riche de modèles de synchronisation 6,7,12. Afin de faciliter une culture reproductible des assemblées de neurones modulaires, un protocole d&#39;assembler l&#39;auto-organisation des réseaux neuronaux en groupes reliés par des axones et dendrites est présentée et décrite. La structure polymère pour le confinement physique des cultures de neurones a été créé à partir polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS est un élastomère largement utilisé pour des applications biomédicales en raison de sa biocompatibilité, la transparence et la 13 perméabilité aux gaz. Le PDMS est préparé et exclu de la micro-usiné SU8 2075 14,15 structures par spin-coating un PDMS liquides sur un «maître» comme décrit précédemment dans Jackman et al. 16 TIl a réalisé modelé réseaux neuronaux sont composés de modules interconnectés de taille différente et ils ont été obtenus avec succès sur les deux lamelles et Micro Arrays électrodes (AME) 17-20. La densité des connexions entre les modules peut changer les caractéristiques de la synchronisation du réseau, à partir d&#39;un réseau entièrement synchronisée, typique des cultures homogènes, à des états transitoires de synchronisation entre modules.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PDMS, Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Vacuum Chamber</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>5305-0609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine PDL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell - Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well culture plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8217;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA1060-Inv-BC</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC02</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>03-033-1c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Minimum Essential Medium-Eagle</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>01-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Electrode Arrays 4Q</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td>
			<td>cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon wafer</td>
			<td>microchem</td>
			<td>SU8-2075</td>
			<td>Preparation protocol: www.microchem.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, surface treatment, cellular plating, and culturing of modular neuronal networks composed of functionally inter-connected circuits

Le cerveau fonctionne par l&#39;activation coordonnée et la communication dynamique des assemblées de neurones. Une question majeure est de savoir comment ouvert un vaste répertoire de motifs dynamiques, qui sous-tendent les fonctions cérébrales les plus diverses, peut émerger d&#39;une organisation topologique fixe et modulaire des circuits du cerveau. Par rapport aux études de circuits neuronaux in vivo qui présentent des difficultés expérimentales intrinsèques, les préparations in vitro offrent une possibilité beaucoup plus grande à manipuler et sonder les propriétés structurelles, dynamiques et chimiques des systèmes neuronaux expérimentales. Ce travail décrit une méthodologie expérimentale in vitro qui permet croissante des réseaux modulaires composés par les assemblées de neurones spatialement distincts, fonctionnellement interconnectés. Le protocole permet de contrôler les deux dimensions (2D), l&#39;architecture du réseau neuronal à différents niveaux de complexité topologique. Une structuration de réseau désiré peut êtreréalisé à la fois sur des lamelles régulières et substrat intégré tableaux micro-électrodes. Structures micro-usinées sont gaufrées sur une tranche de silicium et utilisés pour créer des pochoirs polymères biocompatibles, qui incorporent les caractéristiques négatives de l&#39;architecture de réseau souhaitée. Les pochoirs sont placés sur des substrats de culture au cours de la procédure de revêtement de surface d&#39;une couche moléculaire pour favoriser l&#39;adhérence cellulaire. Après élimination des pochoirs, les neurones sont étalées et ils spontanément redirigées vers les zones revêtues. En diminuant la distance inter-compartiment, il est possible d&#39;obtenir des circuits neuronaux isolées ou reliées entre elles. Pour favoriser la survie des cellules, les cellules sont co-cultivées avec un réseau neuronal de support, qui est situé à la périphérie de la boîte de culture. Des enregistrements électrophysiologiques et optiques de l&#39;activité de réseaux modulaires respectivement obtenus à l&#39;aide de substrats micro intégré réseaux d&#39;électrodes et d&#39;imagerie de calcium sont présentés. Bien que chaque module présente spontsynchronisations mondiaux aneous, l&#39;apparition de synchronisation inter-module est réglementée par la densité de connexion entre les circuits.

Un SU8-2075 moule sur une tranche de silicium avec une épaisseur de caractéristique d&#39;environ 100 um a été utilisée pour façonner le PDMS. Le motif est composé de plusieurs carrés de dimensions, avec une longueur de côté et la distance variant entre 200 et 700 um (figure 1B). La taille de la place a été choisi pour adapter le champ de vision d&#39;un 10X (pour les îles avec une longueur de côté &lt;800 um) et d&#39;un objectif 20X (pour les îles avec une longueur de côté &lt;400 um...

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Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

Ce manuscrit décrit un protocole de croître dans les réseaux modulaires in vitro consistant en l&#39;espace confiné, circuits neuronaux fonctionnellement interconnectés. Un masque de polymère est utilisé pour motif une couche de protéines pour favoriser l&#39;adhérence cellulaire sur le substrat de culture. Plaqués neurones poussent sur ​​les zones revêtues établissant des connexions spontanées et présentant une activité électrophysiologique.

Conception, Traitement de surface, Cellulaire Placage et culture des réseaux neuronaux modulaires Composé de circuits Fonctionnellement Inter-connectées

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

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