Name: sealable femtoliter chamber arrays for cell-free biology
Uploaded: 2015-03-11T15:00:00
Duration: 13 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology at JoVE.com

We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

The authors have nothing to disclose.

ביטוי גנים בתאים הוא מטבעו רועש בשל כרכים סלולריים קטנים ומספרים נמוכים עותק של מגיבים חשובים. ביולוגיה רעש לעתים קרובות מתמקדת במקורות, עיבוד, והשלכות ביולוגיות של תנודות באוכלוסיות, הריכוזים, עמדות, או המצבים של מולקולות השולטות מעגלים גנטיים ורשתות 44. הרוב המכריע של עבודה זו בוצע במערכות סלולריות, שבו יש את היתרון של הצפייה הרעש של מעגל גן בהקשר הטבעי של הרשתות הגנטיות בתוך התא. עם זאת, מערכות תא ללא מאפשרות האפיון של התנודות הפנימיות של מעגל גן בודד ללא תופעות חיצוניות המבלבלות 18 שלא ניתן להימנע במערכות סלולריות. ניתוח של רעש יכול להציע תובנות פיזיות חשובות לאיך גנטי מעגלים בנויים וכיצד הם פועלים, ונעשה שימוש במערכות סלולריות לאפיין 25 וחיוביים שליליים <sup&gt; 27 autoregulation, חיצוני ופנימיות תרומות לרעש ביטוי 18, ותעתיק מתפוצצים 45,46. כאן אנו מתארים את המחקר של מערכת ביטוי תא ללא במכשירי microfluidic המאפשרים השליטה בו זמנית של פעמים גודל כור וייזום תגובה, על מנת להבין טוב יותר את התפקידים שכליאה בצפיפות ויש לי 47,48 על רעש ביטוי חלבון פנימי ללא סיבוכים הקשורים לתאים חיים. מפתח הפעלת תכונה של העיצוב הוא שילוב של מערכים של femtoliter-נפח (מיקרון בקנה מידה) תאים המשמשים לכליאת תגובת המגיבים של מערכת ביטוי חלבוני תא ללא, עם קרום אלסטומרי &quot;שסתום בקרה&quot; בPDMS כי מלכודות מגיבים במוגדרים היטב &quot;זמן אפס&quot;, לייזום תגובה (איור 1). שליטה זו מאפשרת קינטיקה של התגובות מעורבות בסינתזה של חלבונים שfollחב בזמן אמת עם דיוק גבוה. ככזה, חשוב לנהל מגיבים תא ללא כל כך שהשונות הבין-ניסיוניות ממוזערת ככל האפשר. שליטה זו מאפשרת לנו להעריך מבנה רעש של מעגלים גנטיים תא ללא באופן שדומה לטכניקות ששמשו בעבר להערכת ביטוי גנים בתאים חיים. כמגיבים בשימוש במערכות CFPS יכולים להיות רגישים להפשרה להקפיא מחזורים, חשוב לשמור על המגיבים קרים ולצמצם את הזמן המגיבים מבלים הפשרה על קרח. זה תרגול טוב כדי לבדוק מעת לעת את הביטוי של מערכת CFPS בכמויות גדולה על מנת לזהות שינויים ברמות ביטוי לאורך זמן - זה יכול להיעשות בתגובת 10-15 μl בצינור Eppendorf, או במכשיר כמו קורא microplate , אשר מבצע מספר רב של קורא לאורך זמן כדי ללכוד קינטיקה תגובה. בשים לב לגיל והפשרה הפעמים של מגיבים לכל ניסוי יסייע לפתרון בעיות l ביטוי הנמוךevels. יתר על כן, כאשר הרכבת ריאגנטים CFPS, זה חשוב לציין כי התגובה תתחיל ברגע שהיא מורכב בהמלוא והוציאה מהקרח. על מנת לשמור על &quot;זמן אפס&quot; עולה בקנה אחד, כדאי להקליט את הזמן הבא הייזום של תגובת CFPS לאחר התוספת האחרונה של קלט DNA, וליישם את התגובה במהירות אפשרית למכשיר מודגרות. תהליך זה צריך לקחת כ 4-5 דקות, וקרינה לא צריכה להיות עדיין גלויה בתוך תאי התגובה. שליטה זו מבטיחה כי הזמן הפנוי כדי להמחיש את חלק הצמיחה של עקומת התגובה מוגדלת. לפני הפעלת תגובות CFPS במכשיר, מומלץ להריץ בדיקות בקרת איכות כדי לוודא שאין דליפה מהתאים. מבחן FRAP ניתן לבצע (כמו באיור 2 ד) על ידי יישום fluorophore למכשיר ולחשוף גם בודד עד גם הוא מולבן לגמרי. אם התאים הםאטום היטב, אין התאוששות צריכה להיות גלויה בתוך היטב - לא אמור להיות ניגוד מוחלט בין קירות התא וחללי פנים וחוץ. אם התאוששות הקרינה היא לכאורה או הקירות של חדר התגובה אינם מוגדרים היטב, את הלחץ על שסתום הבקרה צריך להיות מוגבר או המכשיר צריך להיבדק לדליפה או delamination משקופיות הזכוכית. פרוטוקול זה נבדק עם ריאגנטים CFPS מE. מסחרי ערכת coli תא ללא ביטוי חלבון (מדורגת 25 μl), אם כי ניתן להשתמש במערכות CFPS החזקה אחרות. ניתן להשתמש בכמויות נמוכות בהרבה מ -25 μl בעת החלת תגובות למכשיר, אשר עשוי להיות שימושיים כאשר עלות מגיב היא גורם מגביל בניסויים. ברגע שמגיבים מתווספים למכשיר ותאי התגובה חתומים, לא ניתן להוסיף מגיבים לפתרון ללא actuating-de שסתום הבקרה - כך המכשיר הזה הוא לא suitable לתגובות אשר דורשות התוספת של חומרים כימיים במהלך התגובה. מכשיר זה גם אינו מותאם לצפייה תגובות CFPS שיכול לרוץ יותר מ 3 שעות - ההשפעות של התייבשות וייבוש של המכשיר לאחר פרק זמן זה לא נבדק. אם זמני תגובה ארוכים יותר הם רצויים, השפעות אלו עשויות להיות מיתנו על ידי איטום המכשיר על מנת למנוע אידוי, שינוי טמפרטורת הדגירה, או על ידי שימוש בתא לחות. שינויים בעיצוב המכשיר, כגון מבני nanoporous בתא הקירות 49,50 או הכללת שכבת קרום נקבובית, מייצגים כמה שיטות שיכולים לאפשר חילופי מגיב ובכך להאריך את לוחות זמני תגובה. תאי תגובת microfabricated של נפח אחיד הם בעלי ערך לשמירה על ממדים עקביים בניסויים ומתאימים מאוד לחקירה &quot;תגובות צד&quot; עם קירות התא. שלא כמו שיטות ללא שימוש בn microfabricated-טכניקות, התגובות האלה חייבת להיות מוערכות במספרים קטנים, ולא מספק גמישות ממדית במהלך ניסויים. עם זאת, העיצוב לשליטה לתאי תגובה אלה הוא מתאים ביותר עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות, ועשוי להיות משלימים מאירים לשיטת תפוקה גבוהה של כליאה.

מערכות תא ללא להציע פלטפורמה פשוטה וגמישה לצפייה תגובות ביולוגיות חופשיים מגורמים שמסבך כגון כושר, החלוקה, ומוטציה שהם בלתי נמנעים במחקר של תאי חיים. גישות כאלה כבר מועסקים ללמוד מערכות סלולריות כוללים האפיון של חלבונים בממברנה 1, חיטוט של אינטראקציות חלבון 2, והחקירה של היבטים בסיסיים של תרגום 3-7. לאחרונה מערכות תא ללא החלו להשיג דריסת רגל כפלטפורמות קיימא עבור ביולוגיה סינתטית 8-10. הערעור של גישות כאלה הוא שהם ישחררו את הביולוגיה סינתטית משיתוף המשאבים ו&quot; הרעש חיצוני &quot;המשפיע על דינמיקת תגובה בתאים חיים. עם זאת נותרו שאלות לגבי איך הסביבה הפיסית שבה תגובות תא ללא מוטבעות משפיעה על ההתקדמות והתוצאה של התגובה. סביבות תגובת תא ללא - environm במיוחד מוגבלמציג המתקרב כרכי תא-רלוונטי - יישאר מאופיין בצורה גרועה. Cell החלבון-חינם הסינתזה (CFPS) היא מחשבה מקובלת של כ&quot; scale-חופשי, &#39;מציג קינטיקה שווה על פני מגוון של microliter לכרכי תגובת ליטר בקנה מידה 11. עם זאת, תגובות כליאת לכרכים בקנה מידה סלולריות הוכחו להשפיע באופן משמעותי שיעורי ביטוי חלבון 12. הטבע סטוכסטיים של תגובות תא ללא - במיוחד כאשר גישת מערכות אלה או אפילו ללכת מתחת femtoliter כרכים - עשוי להיות בעלת חשיבות מיוחדת. רעש בביטוי גנים הוא רכוש המושפע במידה רבה על ידי כליאה כאמצעי אחסון נייד קטן וצפיפות גבוהה של רכיבים לכפות רב של המולקולות החשובות לרמות אוכלוסייה נמוכות מאוד - למשל, גבולות coli Escherichia בתוך fl 1 נפח מתחת לכמה ש4,300 פוליפפטידים שונים השליטה מושרה של כמה מאה יזמים שונים 13. רעש טבוע זו היה מעורב ככוח מניע מרכזי בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל chemotaxis 14, החלטת HIV בין שכפול הפעיל ו -15 חביון, החלטת הפאג λ בין תמוגה וlysogeny 16,17, והחלטת subtillus Bacillus בין הסמכות ונִבִיגָה 17. ביולוגיה סינתטית תא ללא לאחר מכן מספקת גם הזדמנות לחקור את המאפיינים סטוכסטיים של מעגלי גן סלולריים ורשתות, ולטפל התנהגויות אלה כדי להשיג את מטרות טכנולוגיות ספציפיות. בעוד רעש ההתנהגות של מערכות סלולריות נחקרה היטב 18-27, חל חקר קטן של רעש ההתנהגות הבסיסית של מערכות תא ללא 8, במיוחד בקנה המידה הסלולרית. כאן אנו מציגים פלטפורמה לחקר השפעות סטוכסטיים בביולוגיה סינתטית מחוץ לתא. פלטפורמת microfabricated זה מכילה femtoliter בקנה מידת התגובה גhambers אשר עשוי יועבר במהירות בין (דיפוזיה חופשית בתוך ומחוץ לתא) הפתוחה וסגורים (מגיבים מוגבלים בתוך התא) המדינות. במצב הסגור, נגביל מגיבים Cell-חינם חלבון הסינתזה (CFPS) לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), ובצעו את ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות 28 (איור 1). אנו מאפיינים את הסביבה ללא תא הזה על ידי מדידת המבנה של התנודות סטוכסטיים בביטוי גנים באופן ישיר דומה לאלה המשמשים לאפיון תאים 25. שיטות לא microfabrication לכליאת תגובות תא ללא כוללות שלפוחית ​​ויפוזומים 29-32, אמולסיות מים בשמן 12, ותקשורת נקבובית 33. עם זאת, בעוד ששיטות אלה יכולים לספק שליטה על התפלגות הגודל של הכרכים מוגבלים 34, שיטות microfabrication ליצור תכונות שכפול מאוד עם ממדים שצוינו בחוזקה, אפילו בקנה המידה ננומטרי.יתר על כן, ניתן לעקוב אחר מבנים הנוקשים אלה בקלות לאורך זמן מבלי להיות חשוף לאידוי או שינויים בסביבה החיצונית. עיצובי מיכל microfabricated משמשים ב8,35 עבודה קודמות לא יכול לאטום במהירות תאי התגובה הבאה ייזום תגובה, שמסבך את המשימה ברורה של הזמן שבו תגובת יזם (זמן אפס). תוך שימוש בשיטה שהוצגה כאן, רק 4-5 דקות יש צורך בין הייזום ויזואליזציה של התגובה על המכשיר, מתן ובכך מוגדר היטב &quot;זמן אפס&quot;. הפרוטוקולים הבאים מתארים את השיטות לבודה ובדיקה במכשיר זה, ובכלל זה ליתוגרפיה אופטית, הרכבה מכשיר, בדיקת מכשיר, ושיטות לניתוח תמונה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="526">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:151px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:107px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 Thinner</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360 FLUKA</td>
			<td>Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm hole-puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15072</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">23 ga needles blunt tip</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/NE-231PL-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#0 glass coverslip</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>260366</td>
			<td>Gold Seal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse TE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCD camera</td>
			<td>Roper Scientific</td>
			<td>CoolSNAP-HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shutter</td>
			<td>Shutter Insturment</td>
			<td>Lambda SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Light Source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Color Filters</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td colspan="2">ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x oil-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N.A. 1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature Regulator</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>H201-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metamorph</td>
			<td>Universal Imaging Corp.</td>
			<td>Version 7.8.3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marsh Bellofram transducers</td>
			<td>Marsh Bellofram</td>
			<td>T2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 gauge PTFE tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/SWTT-24-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Septum vials</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>C4015- 17W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Power Supply</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td colspan="2">6205B Dual DC Power Supply</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sharp 23 ga needles</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Male-to-male luer lock adapters</td>
			<td>Qosina</td>
			<td>20024</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga.</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/NE-232PL-5C</td>
			<td>Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S30 E coli protein expression system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pet3a-GFP vector/protein</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69418-3</td>
			<td>Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#732-6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexafluor 555</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>AF555</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.46r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: Time Series Analyzer</td>
			<td>Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>Version 3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: StackReg/TurboReg</td>
			<td>Ecole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne Biomedical Imaging Group</td>
			<td>Distribution is dated July 7, 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: ROI Manager Tools</td>
			<td>Tiago Ferreira</td>
			<td>12/15/2013 Version</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sealable femtoliter chamber arrays for cell-free biology

מערכות תא ללא לספק פלטפורמה גמישה לחיטוט רשתות ספציפיות של תגובות ביולוגיות מבודדות משיתוף המשאבים המורכב (למשל, ביטוי גנים הגלובליים, חלוקת תא) נתקל בתוך תאי חיים. עם זאת, מערכות כאלה, המשמשים בכורים בתפזורת מאקרו בקנה מידה מקובלים, לעתים קרובות אינן מצליחות להציג התנהגויות דינמיות ויעילות אופייניות לעמיתי מיקרו בקנה מידת החיים שלהם. הבנת ההשפעה של מבנה תא פנימי וקנה מידה על דינמיקת תגובה היא קריטית להבנת רשתות גנים מורכבות. כאן אנו מדווחים מכשיר microfabricated שמגביל את תגובות תא ללא בכמויות בקנה מידה סלולריות תוך מתן אפשרות לאפיון גמיש של המערכת המולקולרית הסגורה. פולי זה רב שכבתי (dimethylsiloxane) מכשיר (PDMS) מכיל תאי תגובת femtoliter בקנה מידה על קרום אלסטומרי שניתן actuated (פתוח וסגור). כאשר מונעים, התאים להגביל סינתזה תגובות Cell חלבון-חינם (CFPS)להביע חלבון פלואורסצנטי, המאפשר להדמיה של קינטיקה התגובה לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות. כאן אנו מדגימים כיצד מכשיר זה יכול לשמש כדי למדוד את מבנה הרעש של תגובות CFPS באופן שהוא ישירות מקביל לאלה המשמשים לאפיון מערכות סלולריות, ובכך מאפשר את השימוש בטכניקות ביולוגיה רעש בשימוש במערכות סלולריות לאפיין מעגלי גן CFPS ו יחסי הגומלין שלהם עם הסביבה ללא תא.

היתרון הבולט של פלטפורמת microfabricated זה ביישום של &quot;שסתום הבקרה&quot; לשליטה אלסטומרי המונע באופן עצמאי על מנת להגביל את תגובות CFPS (איור 2 א). כאשר ההתקן מונע, תאי הקרום נלחצו שקופיות הזכוכית להגביל ריאגנטים ניאון למערך של תאי תגובה (איור 2 ג). על מנת לוודא שהתאים באופן מהימן להגביל את התגובה דרך את משך הניסוי, FRAP בסיסי (הקרינה שחזור לאחר photobleaching) בדיקה נערך 37. Fluorophore (AF 555) היה מוחל על המכשיר, ושסתום הבקרה היה מונע; באמצעות צמצם התריס של המיקרוסקופ, יחיד גם כליאת fluorophore היה מבודד וphotobleached בנפרד (איור 2 ד). נבחר היטב הפך כהה ולא התאושש בבהירות עד שסתום הבקרה היה depressurized 20 דקות60; מאוחר יותר, משחרר את התא מהזכוכית. בדיקה זו מוודאת כי תאי תגובה אלה נשארים אטומים היטב לתקופת הניסוי. בתנאים אופטימליים, תגובת CFPS להביע חלבון דמיין בקלות (כגון GFP או בלוציפראז) מבטאת חלבון לזיהוי תוך כמה של מוחל על מכשיר זה דקות. במשך החיים של התגובה, סינתזת חלבון בפנים וחוץ של תאי התגובה היא הדמיה ולכמת על ידי מדידת יחידות של עוצמת הקרינה בתוך כל תא (איור 3 א). עוצמת הקרינה, מתאים לריכוז חלבון, עלולה להיות ממופה לאורך זמן לכל תא תגובה (איור 3D). ביטוי גנים הוא תהליך מיסודו סטוכסטיים שמציג תנודות (רעשים) על כל צעד ומולקולרי (סינתזה, השפלה, חלבון-DNA מחייב, וכו &#39;) 20. סניף אחד של ביולוגיה רעש מתמקד בהערך הוכחתי רעש מעגל גן 41. ביטוי במערכות תא ללא יהיה השפעות רעש חיצוניות הנובעות מאינטראקציות בין המכונות מולקולריות של ביטוי והמשטחים המגדירים את הגבולות של כלי התגובה. השפעות חיצוניות אלה צפויים להיות בולטות יותר כתגובות תא ללא מוגבלות לתאי תגובה קטנים עוד יותר. היכולת לבצע זמן לשגות הדמיה של תגובות CFPS מוגבלות מרובות אז מאפשרת ניתוח זהיר של מבנה רעש (גודל ודינמיקה) במערכות תא ללא מוגבלות באופן ישיר דומה לשיטות שדווחו למערכות סלולריות 25. איור 3 ג ו3D להראות קורסי ביטוי GFP מכונן מאמרגן T7 הזמן בmicroplate 384 גם סטנדרטי עם גם נפח של 15 μl, בהשוואה לתאים בתגובה PDMS 10 מיקרומטר קוטר, המקביל לכרכים של רק כ -300 fl, על שבע כדישל גודל פחות. השונות בשיעורי ביטוי חלבון בתאי 10 מיקרומטר התגובה היא הרבה יותר גבוהות מאשר במדידות היטב צלחת, מתקרבים לאלה הנראים בתאים. תגובות מרובבות שבוצעו על המכשיר להציג קינטיקה דומה לתגובות CFPS מבוצעות בכמויות גדולות על microplate קורא (איור 3), שבו יש עלייה מהירה בקרינה שמישורים, לעתים קרובות להניח להיגרם על ידי הגבלת משאבים בתוך נפח התגובה 42,43 . זה התנהגות צמיחה דטרמיניסטית, למרות תנודות, היא בדרך כלל עקבית בכל תאי התגובה, ובין ניסויים - על ידי חישוב ממוצע עקבות בין תאים על פני ניסויים, המגמה הדטרמיניסטית עשויה להיגרע מערכי עקבות, שעזבה את רכיבי הרעש היחיד של התגובה (איור 4 א) . איור 4 מציג את רעש ביטוי GFP לאחר הסרת הרכיב הדטרמיניסטי, חולף (למעלה), וautocorrelation של הרעש (למטה), ואילו איור 4 א מציג את העקבות המקבילות ב10 מיקרומטר תאי תגובה. ההפצה במחצית-הפעמים של עקבות autocorrelation נותנת את התלות בתדר של הרעש, תוך זמן אפס הפיגור של עקבות autocorrelation נותן גדלים של הרעש, כשונות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig1.jpg" /> 1. מגיבים סינתזה של חלבוני תא-חינם איור נכלאים בתאי תגובה בקנה מידה femtoliter לצורך מדידת רעש ביטוי גנים. ריאקטיבים ממערכת ביטוי חלבוני תא ללא מסחרית משמשים לconstitutively מפורש GFP בתוך מוגבלים תאי תגובת PDMS. מערך של תאים אלה עשויים להיות דמיין עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות כדי לאפיין ביטוי חלבון ורעש ביטוי גנים. O עוצמת הקרינהf כל תא תגובה לאורך הזמן ניתן להתוות כעקבות בודדות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig2.jpg" /> איור 2. ייצור של מכשיר microfluidic דו שכבתי עם תאי femtoliter בקנה מידת סגר. פריסה () והתפוצצו תצוגה של שכבות מכשיר. המכשיר מורכב משתי שכבות PDMS וcoverslip זכוכית. קרום PDMS, האטום בין שכבות שסתום זכוכית ושליטה, מחזיק תאי התגובה. תמונת SEM (ב) לתא תגובת PDMS. הקוטר הפנימי הוא 10 מיקרומטר. סכמטי (C) של ערוצי קלט במכשיר. ריאגנטים Cell חלבון-חינם סינתזה (CFPS) מוטסים דרך ערוץ התגובה. מים בלחץ בשליטהשסתום כדי לדחוס את תאי התגובה נגד שקופיות הזכוכית, איטום החדרים 37. לשכפל מRef. 37 באישור האגודה המלכותית לכימיה. (D) שחזור הקרינה לאחר photobleaching מבחן (FRAP) על אחת גם באמצעות FITC מציין קאמרי הוא אטום היטב נגד סביבה חיצונית. Fluorophore נתפס בתאי (התמונה עליונה) וגם אחת היה photobleached (תמונה תחתונה). אין התאוששות הקרינה נתפסה בתא photobleached עד שסתום הבקרה שוחרר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig3.jpg" /> ביטוי איור 3. EGFP בתגובת תא-חינם מרותקת. () תמונות הקרינה של אטום התגובה ג<html> hambers בנקודות זמן שנבחרו בתגובה. ייצור חלבון שניתן לראות, הוא בתוך תאי התגובה ומחוץ לתאים בערוץ המרכזי. (ב) EGFP שובט לתוך וקטור Pet3a, מתן אמרגן פולימראז T7 ושליחות קטלנית ואתר הריבוזום החזק מחייב (RBS). (ג) מדידות הקרינה מנורמלות של ביטוי המכונן של EGFP בתגובת תא ללא תפזורת מתבצעת בקורא microplate. תגובות CFPS בדרך כלל לייצר חלבון במהירות לפני שההאטה לקרינה &quot;מצב יציב&quot; - זה קשור להגבלת משאבים 43. מקפים שחורים מציינים עקבות הממוצעת. הקרינה מנורמלת של 51 עקבות עוצמת הקרינה גלם לקרוא מ -51 תאי תגובה על כמה ניסויים (D). מקפים שחורים מציינים עקבות הממוצעת על פני מספר ניסויים, הממחישים את הרכיב הדטרמיניסטי של ביטוי החלבון.&quot;Target =&quot; /52616/52616fig3large.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig4.jpg" /> איור 4. עקבות רעש פרט וautocorrelation רעש של מערכת סלולרית וניידת-חינם. (א) מאוסטין et al., 2006. רעש בביטוי של GFP (למעלה) ופונקציות מנורמלות autocorrelation (למטה) שנרכשו מייצור GFP מעקב בחיים חיידקים 25. הודפס מחדש באישור ממקמילן מוציאים לאור בע&quot;מ: [טבע] 25 (. כרך 439), זכויות יוצרים (2006). רעש בביטוי של GFP (למעלה) ופונקציות מנורמלות autocorrelation (למטה) שנרכשו מייצור GFP במערכת תא ללא (B), במעקב בתאי תגובת מכשיר microfluidic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן</a>כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology at JoVE.com

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

מערכים רבים סגר Femtoliter הלשכה לביולוגיה ללא סלולארי

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

תא ללא חלבון ביטוי באמצעות החיידק גדל במהירות ויבריו natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

הייצור של Ti3C2 Mxene מערכים מיקרואלקטרודה בVivo הקלטה עצבית

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

OnePot PURE Cell-Free System

מערכת ללא תאים טהורים של OnePot

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...