Name: dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques
Uploaded: 2015-03-13T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques at JoVE.com

Denne meddelelse bygger på resultaterne tidligere offentliggjort i virologi Journal17 i åben adgang mode under vilkårene i Creative Commons Attribution License (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) med BioMed Central som en licenstageren. Forfatterne taknemmeligt anerkender det frugtbare samarbejde inden for rammerne af lodstjeneste undersøgelsen "Narkotika og kroniske infektionssygdomme" ("DRUCK studere") med U. Marcus, W. Cai, W. Zhang og R. Zimmermann fra Robert Koch-Institut (Berlin, Tyskland) og er taknemmelige for S. Moyrer for at tage fotografier samles i figur 1 samt om D. F. Whybrew, ph.d., (Göttingen, Tyskland) til at korrigere den håndskriftet. De også udtrykke deres påskønnelse af dygtige tekniske bistand til J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, M. Schröter og K. Seidel. Denne undersøgelse var delvist understøttet af et tilskud af det tyske sundhedsministerium til det nationale referencecenter for Hepatitis C.

Da protokollen er udviklet til brug i medicinsk diagnostik, skal dens anvendelse følge principperne i Helsinki-erklæringen19. For den første del af resultaterne præsenteres i denne meddelelse, både en separat aftale af patienterne og godkendelse af et etisk udvalg syntes at være undværes for to grunde: (1) "ved adgang" til Essen University hospital, "hver patient giver skriftligt samtykke til alle nødvendige biokemiske, bakteriologiske og virologiske undersøgelser." 17 (2) "alle prøver anvendes i hele evalueringen af DBS test blev sendt til instituttet virologi i rutinemæssig klinisk diagnostik. Således ingen af prøverne var indsamlet specifikt med henblik på undersøgelsen, ikke en enkelt yderligere venepunktur blev udført, og ingen af materialerne blev testet for alle parametre end dem, der kræves af læger i løbet af normalitet diagnostisk arbejde op." 17 undersøgelse "Narkotika og kroniske infektionssygdomme" (DRUCK studere")18, hvor DBS test blev endelig brugt i de tyske byer i Berlin og Essen for at evaluere stiknarkomaner aktivt, blev godkendt af Federal kommissær for Data Beskyttelse og frihed af oplysninger (Berlin, Tyskland) og så godt som af den etiske komité i den medicinske universitet Charité, (Berlin, Tyskland).
1. indsamling af blod
<ol><li>Venepunktur14, 15, 20, 21<ol>
<li>Sætte på engangs latex gummihandsker, og rengør området af webstedet tilsigtede punktering (helst den mediane kubiske vene i antecubital fossa) med et passende desinfektionsmiddel, fx, 70% isopropylalkohol.</li>
		<li>Anvende en tourniquet 4 – 6 inches over formodede punktering site til at svulme op i venerne. Guide nålen ind i patientens vene, og når det er på plads, forsigtigt fylde tilsluttede blod rør, der indeholder EDTA som en antikoagulans.</li>
		<li>Så snart venepunktur er komplet, frigive en årepresse og hæve nålen. Tryk derefter på en tør gaze pad på webstedet punktering, som efterfølgende kan blive holdt på plads af en forbinding.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hud punktering (figur 1A)13-15, 20, 22, 23<ol>
<li>Sætte på en par engangs latex gummihandsker.</li>
		<li>Før hud punktering, bør patienten varm hans/hendes hænder. Fingeren er masseres anterogradely enrich blodgennemstrømningen mod for at punktere site.</li>
		<li>Ren hud af palmar side af tip distale phalanx af den tredje eller fjerde finger af ikke-skrivning hånd med et egnet desinfektionsmiddel, fx, 70% isopropylalkohol. Punktere huden af en single-brug Sikkerhedslancetten. Fingeren skal holdes i en sådan position, at tyngdekraften letter indsamling af blod på fingerspidsen.</li>
		<li>Når samling af kapillær blod af hud punktering er fuldført, skal du placere en forbinding på finger spidsen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. forberedelse af blod pletter
<ol><li>Forberedelse fra blod indsamlet af venepunktur15<ol>
<li>Spot indsamlede anti-koagulerede (EDTA) hele venøse blod på filter kort så hurtigt som muligt. Forbered ikke tørrede blod steder mere end 24 timer efter venepunktur.</li>
		<li>Sætte alle oplysninger, der nødvendige til identifikation af patienten på filterkortet. Ét kort bør være opdaget kun med blodet fra et enkelt individ.</li>
		<li>Sætte på engangs latex gummihandsker.</li>
		<li>Forsigtigt vendes blod collection tube 2 – 4 gange og derefter åbne proppen omhyggeligt.</li>
		<li>Opsug 50 µl af hele venøse blod ved hjælp af en pipette med en engangs spids. Overføre blodet til midten af en cirkel uden at røre filtrerpapir direkte med spidsen af en pipette. Prøv at fuldt mætte cirklen.</li>
		<li>Gentag denne fremgangsmåde for at udfylde alle påkrævede cirkler på kortet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse fra blod indsamlet af hud punktering (tal 1B og 1 C)13-16, 23<ol>
<li>Aftørre den første dråbe blod hos en gauze afrivningsblok, fordi det kan indeholde overskydende væv væsker. Massage finger igen for at øge blodgennemstrømningen på webstedet punktering. Overfør følgende drop til en af cirkler i et filterkort uden at berøre overfladen direkte med fingerspidsen. Tillade blodet at være gennemblødt i teksturen af filteret af kapillære kræfter kun.</li>
		<li>Lad den næste store drop af kapillær blod form på finger-tip og samle det i den næste cirkel. Fortsæt denne procedure, indtil alle nødvendige cirkler er fyldt eller blodgennemstrømning stopper.</li>
		<li>Ikke klemme eller "mælk" finger overdrevent hvis blodgennemstrømningen ikke er tilstrækkelig til at fylde alle de krævede cirkler af filterkortet. Hvis blodgennemstrømningen stopper Placer en forbinding på finger-tip. Udføre en anden hud punktering på en anden finger mere blod er nødvendig for undersøgelsen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. tørring af blod pletter
<ol><li>For at tørre blod steder, sætte filteret kortene på en ren papir håndklæde i en biologisk sikkerhed kabinet og lad dem tørre, helst O/N (men for mindst 4 timer), på RT i mangel af nogen ydre kilde til varme. Når tørringen er færdig, blod steder har en ensartet mørk brunlig farve og ingen røde områder kan ses længere (figur 1 d)13, 15, 16.</li>
</ol>4. opbevaring og transport af tørrede blod pletter (DBS)
Bemærk: Behandlingen af blod pletter kan afbrydes efter tørring. Kortenes filter kan nu blive gemt13-16, 23.
<ol><li>Til opbevaring, sætte kortet filterpapir i en enkelt, gas-vandtætte lynlås pose, der indeholder 1 til 2 tørremiddel breve for at beskytte prøverne fra fugt (figur 1E). Du kan eventuelt tilføje en luftfugtighed indikator kort.</li>
	<li>Overføre denne taske til en fryser med en temperatur på-20 ° C eller lavere hurtigst muligt. Hvis frysere ikke er tilgængelige under markforhold, er opbevaring på-4 ° C eller selv ved stuetemperatur muligt i op til 14 dage.</li>
	<li>Transport af frosne DBS prøver på tøris. Filter kort i første omgang opbevares ved omgivende temperatur, bruge en tredobbelt pakkesystem, som består af lynlås bagage som den indre emballage samt en indre og en ydre konvolut. Ingen indhold markeringer er påkrævet på kuvert til afsendelse med almindelig post, men internationale biohazard symbol skal anbringes på de primære indvendige beholder16.</li>
	<li>Udelukke filter kortene fra yderligere behandling, hvis de tørremiddel packs og/eller ekstra fugtighed indikator kortet ændres til en lyserød farve.</li>
</ol>5. eluering af tørrede blod steder13, 15, 16, 23
<ol><li>Punch ud et sted med en enkelt-bruger 6 mm enhed i hver enkelt blodige cirkel med Grade 903 filterkortet (figur 1F). Overføre alle udstansede tørrede blod steder fra en enkelt patient til et godt af 12-godt plade.</li>
	<li>Fyld godt med fosfatbufferet saltopløsning med 0,05% Tween 20 og 0,08% natriumazid (figur 1 g). Tilpasse mængden af tilsat buffer til analysen bruges til efterfølgende analyse af tørret blod steder eluater minimal respektive krav.</li>
	<li>Gentag disse trin for at få en anden serie af tørrede blod spot eluater for at udføre molekylære analyser.</li>
	<li>Sætte celle kultur plade på et laboratorium shaker og lad den udstansede tørrede blod pletter forsigtigt elueres i mindst 4 timer eller, helst, O/N (figur 1 H).</li>
	<li>Den næste dag, steder er næsten fri for blod og hæmolytisk analysere har dannet (figur 1I). Overføre disse eluater microcentrifuge rør. Derefter, underkaste dem centrifugering i 2 min på 10.500 x g (figur 1J) til gratis supernatanter fra eventuelle rester, der havde dannet under eluering (figur 1 K).</li>
</ol>6. analyse af eluater
<ol><li>Centrifugeret eluater er nu klar til at blive anvendt til de tilsigtede analyser. Undersøge eluater for markører for hepatitis B virus, hepatitis C-virus og HIV-infektion ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits og følge de respektive producenter vejledningen nøje (figur 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> Figur 1. Grafisk oversigt over protokollen foreslås i denne meddelelse for forberedelse og forarbejdning af tørret blod steder skal anvendes i immunassays og af molekylærbiologiske teknikker. Hele venøse blod og kapillær blod fremstillet af enten venepunktur eller punktering af huden ved en lancet (A) kan tjene som prøver for tørrede blod spot analyse. Efter overførsel af blod til cirkler i et Grade 903 filterkort (B, C), skal prøverne tørres helst O/N ved stuetemperatur i en biologisk sikkerhed kabinet til form steder af en jævnt brunlig farve uden nogen interspersion af rød områder (D). Når tørring af blod steder er komplet og lagerplads er nødvendige, filter kortene kan pakkes i gas-vandtætte lynlåsposer indeholdende 1 – 2 tørremiddel breve (E). Laboratoriet videreforarbejdning af DBS omfatter generation af slag af en 6 mm engangsbrug enhed fra midten af cirkler (F, G), eluering af slag i en PBS-baseret buffer i mindst 4 timer eller, helst, O/N på en shaker (H ), inddrivelse af eluater, (jeg), og endelig centrifugering af laboratoriet kopper (J) til gratis DBS eluater fra eventuelle rester, der kan være opstået under eluering proces (K). Efterfølgende er DBS eluater klar til analyser, der blev udført af en fuldt automatiseret platform (L) for at detektere serologisk markører for HBV, HCV og HIV infektioner, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

I fortiden modtaget RSR et honorar for at levere foredrag og finansiel støtte til hans videnskabelige arbejde fra Abbott Diagnostics. NG og OM erklærer, at de har ingen modstridende interesser.

DBS har været anvendt i 100 år2 , men overraskende, er der stadig ingen generel enighed om deres forberedelse og behandling. Til dato, er en tilstrækkelig standardisering af denne vigtige pre analytiske fase kun sket inden for nyfødte screening14, mens en lang række forskellige protokoller findes for alle andre anvendelser af DBS test5, 16, 23. For at overvinde denne bemærkelsesværdige heterogenitet, et omfattende trin for trin instruktion for forberedelse og forarbejdning DBS til at blive udnyttet i immunassays og af molekylærbiologiske teknikker præsenteres i denne meddelelse og evalueret med hensyn til dens effektivitet til påvisning af markører for HBV, HCV og HIV infektioner. Fokus for den følgende diskussion er primært placeret på de forskellige trin i den foreslog protokol.
I historien om DBS teste mange forskellige filtrerpapir kort har været brugt2 , men i dag kun to kommercielle kilder er godkendt af FDA som medicinsk udstyr i klasse II for blod samling5, 16. Disse filter kortsystemer er meget ensartet og har meget lignende absorption egenskaber, så analytiske resultater fra kapillær blod parat på nogen af dem ikke afviger med mere end 4%-5%28. Ikke overraskende, Masciotra og co-arbejdere29 derfor fundet HIV-1 RNA lige godt med en kvalitativ analyse efter eluering fra blod samling kort fra forskellige kilder. Da disse data, kan stort set udelukkes, at nogen af afvigelser observeret ved afprøvning af kombineret serum/DBS par for markører for HBV, HCV og HIV infektioner17 var forårsaget af valget af filterkortet alene. Dog når nøjagtig kvantificering af en analysand er uundværlig, kilde til kildevariationen kan ikke længere være ubetydelig og mere avancerede teknikker, f.eks., perforeret DBS (UDHULING) som en metode til microsampling30 eller præparatet af tørrede serum steder skal (DSS)31 anvendes i stedet for konventionelle DBS test10.
Da kun små mængder af blod anvendes til DBS test (en dråbe af kapillær blod består af ca. 50 µl)5, 16, variationer i stikprøven volumen er afgørende og, ganske vist på mindst nogle af uoverensstemmelserne mellem serologiske resultater og deltagerens selvrapporterede HBV og HCV status registreres under lodsning af "DRUCK undersøgelse" kan henføres til denne variabel. Den vigtigste faktor for at minimere "udsving" sample volumen er utvivlsomt en korrekt teknik af kapillær blod collection, som kun kan opnås ved omhyggelig og løbende uddannelse af teknikere22. Desuden, som et mål for kvalitetskontrol, burde alle laboratorier, der arbejder med DBS have allerede indledt procedurer til at identificere og efterfølgende undtagen DBS prøver, der skal betragtes som utilfredsstillende eller ugyldig16.
Undersøgelser udført primært i forbindelse med HIV32 og nyfødte screening33 har vist, at høj luftfugtighed kan føre til en forringelse af analysander, men hidtil ikke har været enighed med hensyn til spørgsmålet om, hvor længe DBS bør være lufttørret . Et interval på mindst 4 hr eller helst O/N foreslås i denne meddelelse, som derfor vedtog betingelser, der blev brugt i langt størstedelen af alle relevante publikationer32, 34 Data på opbevaring af DBS anvendes efterfølgende til HBV og HCV test er modstridende. I 1981, Villa og kollegaer35, der anvendes moderne analyseteknikker, rapporterede, at opbevaring på RT ikke påvirkede resultaterne af HBV analyser i hele observationsperioden 180 dage hvis antistof titers var > 1/1.000, men at DBS blev borderline-positive eller endda negative efter 15 dage når titers i serum var kun 1/100. Opbevaring ved-20 ° C og 4 ° C ikke resultere i en væsentlig forbedring. Derimod en undersøgelse udført 30 år senere36 testet replikater af en HBV-positive prøve, og forfatterne fandt at anti-HBc samt anti-HBs antistoffer var stabilt op til 183 dage på RT, mens HBsAg på samme betingelser blev falsk negative allerede efter 63 dage. Med hensyn til påvisning af HBV DNA fra DBS eluater, koncentrationen af den virale nukleinsyre var stabil i mindst syv dage ved 37 ° C37 eller viste sig for at være "resistent" til opbevaring på RT for op til tre uger38. Undersøgelser for anti-HCV antistoffer ved hjælp af to kommercielt tilgængelige tredje generation immunassays39 fastsatte 117 dage ved hjælp af DBS prøver opbevares ved-20 ° C, 2-8 ° C og 20 – 25 ° C, henholdsvis præcise resultater. Opbevaring ved-20 ° C, men resulterede i den laveste variation af optiske tætheder. Anvendelse af en fjerde generation anti-HCV ELISA, dvs Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, i forbindelse med DBS test, Larrat et al. 40 observeret en skarp nedgang i analytiske specificitet efter lagring DBS eksemplarer i mere end tre dage på RT. På den anden side blev præcis test resultater opnået med den samme kit udnytte prøver deponeret i 60 dage under forskellige betingelser (-20 ° C, 2-8 ° C og 22 – 26 ° C) ved Brandao og co-arbejdere41. Bemærkninger om tilbagegangen af HCV RNA koncentrationer i DBS under forskellige opbevaringsforhold spænder fra ingen væsentlig ændring på RT for op til 1 år42 til en tidobbelt ændring efter fire uger ved stuetemperatur43. Tager denne temmelig modstridende data om stabilitet af HBV og HCV antigener, nukleinsyrer og antistoffer i betragtning, virkede det fornuftigt at trække i den foreslåede protokol til en konsensus, som blev defineret tidligere til opbevaring af DBS prøver anvendes til HIV-testning15, 30: For kortsigtede deposition (op til to uger) antigener, viral nukleinsyre og antistoffer betragtes som stabil på RT, optimal opbevaring i længere perioder er på frosne betingelser.
Som regel tre parametre bør overvejes, når du udformer en eluering protokol: (1) eluering buffer; (2) varighed og temperaturen af eluering; og (3) eluering bind23. I langt størstedelen af alle relevante publikationer fosfatbufferet saltopløsning (PBS) blev brugt til eluerer DBS, og de fleste forfattere tilføjet et protein, fx, bovint serumalbumin (BSA) eller Tween 20, et overfladeaktivt stof, for at forbedre analysen signal ved at stabilisere proteiner, som de går ind i løsning, og samtidig blokere ikke-specifik binding websteder23. Kun et par rapporter, der direkte sammenligner forskellige eluering buffere i forbindelse med DBS test, er tilgængelige. Villar et al. 36, fxindspillet næsten tilsvarende eluering kapacitet for alle buffere anvendes, men PBS/BSA 0,5% resulterede i det laveste niveau af uspecifik reaktivitet. En meget lignende observation blev foretaget af Croom og co-arbejdere44 når du anvender prøvefortynder af genetik systemer rLAV VVM for eluering af anti-HCV antistoffer fra DBS. Da risikoen for prøve nedbrydning er overordentlig lav i de første timer efter tilberedning af DBS (se ovenfor), blev det besluttet at udruge steder O/N ved stuetemperatur og støtte den eluering af blid slut over blanding. Denne fremgangsmåde har den fordel, at prøver hulles ud den foregående dag kan direkte overføres til rutinemæssig diagnostik tidligt næste morgen23. Mængden af eluering buffer bør tilpasses til de minimale respektive krav af assays bruges til efterfølgende analyser for at holde fortyndingsfaktoren så lavt som muligt. En omhyggelig optimering af eluering betingelserne for hver enkelt analysand var imidlertid ikke muligt i den forudgående evaluering, fordi enårlig høj prøven skulle sikres i en forholdsvis kort tid under "DRUCK undersøgelse"17. Derfor, den temmelig ugunstige volumen af 1.000 µl af PBS-baseret buffer blev brugt for at fuldføre hele eluering proces for alle parametre i to separate handlinger.
Denne tilgang, en den ene side mislykkes "helt i den anti-HBc/anti-HBs system for personer smittet med HIV på grund af de lave antistof koncentrationer; ... og det krævede Molekylær biologiske procedurer med optimal analytiske følsomhed med hensyn til HBV DNA og HCV RNA tests. " 17 på den anden side høj eluering volumen viste sig på ingen måde ufordelagtige for bestemmelse af HBsAg, anti-HCV og anti-HIV af kits bruges i hele evalueringen. "Påvisning af HBsAg positive materialer fra fuldblod eluater lykkedes med en følsomhed på 98,6% til en tilsvarende høj grad som i tidligere undersøgelser, som delvis havde brugt en meget mindre eluering volumen af 100 µl, 250 µl, eller 600 µl og 500 µl"17 ,36, 45, 46. Følsomheden af 97.8% fastsat i undersøgelsen af 179 serum/DBS par for anti-HCV antistoffer svarede til resultater af allerede eksisterende rapporter24, 44, 47, 48, 49, som havde arbejdet med en eluering volumen, der var lavere med en faktor på 5 til 10. "Derudover protokoller for anti-HCV påvisning havde været passende optimeret... af varepartierne deres egen cut-off point"17, 24, 48, 49 "eller ved at øge prøve diskenheder fra 20 µl til 100 µl." 17, 49 endelig analytiske specificitet og følsomhed (100%) etableret for anti-HIV opdagelse var lig eller overlegen i forhold til karakteristika for andre immunassays specifikt Tilpasset DBS test50, 51 ydeevne "eller en trinvis proceduren med den kombinerede brug af flere anti-HIV-test"17,52. "De, ja, også overskredet effektivitetsdata for en analyse, der er blevet specielt udviklet og optimeret til påvisning af anti-HIV antistoffer i DBS eluater (Q-forhindre HIV 1 + 2 DBS kit)." 17, 53  
Tilsammen, den omfattende trinvise protokollen præsenteres i denne meddelelse viste sig for at være et realistisk og brugervenligt værktøj til forberedelse og behandling af DBS og kan således anvendes pålideligt i diagnostisk virologi. Det tillader tilgange ved hjælp af automatisering 54 og på grund af dets fremragende egenskaber har potentiale til at tjene som en slags grundstenen til en kommende generelt accepteret konsensus protokol i feltet global DBS test i laboratorium medicin.

Tanken om at bruge blod indsamlet på et papir kort lavet af cellulose er tilskrevet Ivar Christian Bang (1869-1918), far til moderne kliniske mikroanalyser1, 2. I 1913, bestemmes Bang glukose fra eluater af tørrede blod steder (DBS)3 og nyere, optrådte også kvælstof målinger ved hjælp af Kjeldahl-metoden med denne filtrerpapir teknik2. Senere, flere efterforskere rapporteret om brug af DBS serologisk test til at diagnosticere syfilis2. Så tidligt som i 1924, Chapman opsummeret fordele af DBS test når han især understregede fire elementer, som er stadig gyldige i dag: (1) i forhold til konventionelle venepunktur, mindre blodvolumen er påkrævet og dette faktum var vigtigst i pediatric diagnostik; (2) indsamling er enkel, ikke invasiv og billig; (3) risikoen for bakteriel forurening eller hæmolyse er minimal; og (4) DBS kan bevares for lange perioder med næsten ingen forringelse af analysander2, 4. Udover sin brug i test for syfilis, inkluderet yderligere tidlige programmer af DBS teknik, f.eks.påvisning af antistoffer mod mæslinger, fåresyge, poliovirus, parainfluenza virus og respiratorisk syncytial virus (RSV) i 19532, identifikation af Shigella i afføring tørres på filtrerpapir og sendes med almindelig post fra Indonesien til Leiden i Holland samt påvisning af antistoffer mod Schistosoma i DBS taget i endemiske områder og analyseret mere end tre måneder senere5 . I 1963 udgivet halvtreds år efter Bangs oprindelige meddelelse2, 6, Guthrie endelig sin berømte metode til diagnosticering af fenylketonuri fra DBS fremstillet ved en hæl prick fra nyfødte7, 8.
Selv om fra dette tidspunkt og fremefter, betragtedes DBS som et almindeligt gældende metode til indsamling, lagring, transport og analysere en bred vifte af menneskelige kropsvæsker5, deres anvendelse i diagnosticering stadig forblev overvejende fokuseret på diagnosticering af infektioner især i ressource-begrænset indstillinger og den systematiske screening af nyfødte for arvelige stofskiftesygdomme i årtier9, 10. Siden 2005 har imidlertid en række nye og innovative DBS applikationer begyndt at dukke op. Dette resulterede i en næsten eksponentiel stigning i antallet af respektive videnskabelige publikationer på DBS fra omkring 50 til næsten 450 årligt på nuværende tidspunkt. Blandt de nye programmer er forskellige områder som toksikologisk - og Farmakokinetiske undersøgelser, metabolisk profilering, terapeutiske drug overvågning, retsmedicinske toksikologi eller miljømæssige forurening kontrol10, 11.
DBS test har således gjort et triumftog march gennem klinisk laboratorie diagnostik i løbet af sidste 100 år2. Som i klinisk kemi12, dog ansås under denne marts pre analytiske variabler ikke tilstrækkeligt i mange år. Ja, selv i dag, efter fremtrædende aktiviteter såsom CDCS filtrerpapir evaluering projekt13 eller formulering af en national standard for blod samling på filtrerpapir inden for rammerne af nyfødte screening14, den pre analytiske fase er stadig i vid udstrækning undervurderet i de fleste andre felter, hvor DBS test er anvendt5, 10.
Denne baggrund en omfattende trinvise protokol14-16 til brug i immunassays og molekylære teknikker, som dækker alle de væsentlige skridt, er foreslået for forberedelse og forarbejdning DBS i følgende meddelelse: (1) samling af blod; (2) udarbejdelse af blod steder; (3) tørring af blod pletter; (4) oplagring og transport; (5) eluering af DBS; og endelig (6) analyser af DBS eluater. Effektiviteten af protokollen blev første gang evalueret med 1,762 koblede serum/DBS par til påvisning af hepatitis B virus (HBV) overflade antigen (HBsAg), antistoffer mod HBV core antigen (anti-HBc), antistoffer mod HBV overflade antigen (anti-HBs), HBV DNA, antistoffer for hepatitis C virus (HCV) (anti-HCV), HCV RNA, og human immundefekt virus (HIV) 1-p24-antigen/anti-HIV 1/2 ved hjælp af enten en fuldt automatiseret platform eller følsomme kvalitative nukleinsyre tests. 17. i et andet trin, protokollen blev udnyttet i de Pilotundersøgelse "narkotika og kroniske infektionssygdomme" ("DRUCK studere") som blev gennemført af Robert Koch-instituttet i tæt samarbejde med de nationale Reference Centre for Hepatitis C på aktiv stofmisbrugere i de tyske byer i Berlin og Essen18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Latex rubber gloves</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#4049500041515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td>#9768050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulifly safety cannula</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#85.1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA blood collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#02.1066.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#2994163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry gauze pad</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#143213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singel-use safety lancet</td>
			<td>Owen Mumford</td>
			<td>#3802421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Card</td>
			<td>Whatman/sigmaaldrich</td>
			<td>#10534612</td>
			<td>Filter paper card Grade 903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>#S1126-7810, #S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper bag</td>
			<td>Flexico</td>
			<td>#20219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini desiccant bag</td>
			<td>Tropack</td>
			<td>#-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Punch</td>
			<td>pfmmedical</td>
			<td>#48601</td>
			<td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Forceps</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>#H7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A1389.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#66880250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HBsAg (Qunatitative)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBc II</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#8L4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBs</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#7C1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HCV</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#4J2727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#6374891001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artus HBV LC PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td>#2554311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

Tanken om at indsamle blod på et papir kort og efterfølgende bruger den tørrede blod pletter (DBS) til diagnosticeringsformål stammer fra et århundrede siden. Siden da, DBS test for årtier har været overvejende fokuseret på diagnosticering af infektiøse sygdomme især i ressource-begrænset indstillinger eller den systematiske screening af nyfødte for arvelige stofskiftesygdomme og først for nylig har en række nye og innovative DBS programmer er begyndt at dukke op. I mange år, før analytiske variabler ansås kun uhensigtsmæssigt i feltet af DBS afprøvning og selv i dag, med undtagelse af nyfødte screening, den hele pre analytiske fase, der omfatter forberedelse og behandling af DBS for deres endelige analyse har ikke været standardiseret. Denne baggrund er en omfattende trinvise protokol, som dækker al de væsentlige faser, foreslået, dvs. samling af blod; forberedelse af blod pletter; tørring af blod pletter; opbevaring og transport af DBS; eluering af DBS, og endelig analyser af DBS eluater. Effektiviteten af denne protokol blev første gang evalueret med 1,762 koblede serum/DBS par til påvisning af markører for hepatitis B virus, hepatitis C-virus, og human immundefekt virusinfektioner på en automatiseret analytiske platform. I et andet trin, blev protokollen udnyttet i løbet af en pilotundersøgelse, som blev gennemført på aktive stofbrugere i de tyske byer i Berlin og i Essen.

Effektiviteten af protokollen foreslog for forberedelse og forarbejdning af DBS blev første gang evalueret ved at analysere 1,762 koblede serum/DBS par for markører for HBV, HCV og HIV-infektion. 17. med henblik herpå DBS blev udarbejdet fra 100 µl hele venøse blod (jf. punkt 2.1.1 – 2.1.6 af den foregående protokol) og blev elueret med 1.000 µl af PBS-baseret buffer, hver, (jf. punkt 5.1-5.5 af den førnævnte protokol) for at fuldføre processen for alle syv parametre i to separate handlinger. En sådan fremgangsmåde uden omhyggelig optimering af eluering betingelserne for hver enkelt analysand syntes at være uundgåelige, fordi en temmelig høj sample gennemløb var forventet i en forholdsvis kort tid under den kommende feltundersøgelse "narkotika og kronisk Smitsomme sygdomme"("DRUCK undersøgelse").
Alle målinger levet op til producentens anbefalinger i forbindelse med DBS analyser men måtte ændres for så vidt angår HBsAg og anti-HBs bestemmelser at kompensere enten for effekten af hæmolyse eller resultatet af fortynding. Med en cut-off værdi på 0,05 IU/ml, HBsAg test af DBS eluater fører til en sats i falsk-positive af 14,7% (52 ud af 354) i forhold til serum prøver (figur 2A). Modtager opererer karakteristiske (ROC) analyse25, 26 data angivet, en stigning på tærsklen til 0,15 IU/ml ville resultere i en ideel adskillelse af HBsAg-positive fra HBsAg-negativer (0.986 [følsomhed], 0.000 [1-specificitet], Figur 2B). På den anden side med en cut-off af 10 IU/l til kvantificering af anti-HBs optaget antistoffer en sats i falsk negative målinger af 14,2% (47 ud af 331) blev (fig. 2 c). Derfor, efter ROC analyse igen, denne cut-off blev sænket til 1,5 IU/l til at opnå en optimal forskelsbehandling af værdier (0.917 [følsomhed], 0,007 [1-specificitet], figur 2D).
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> Figur 2. HBsAg og anti-HBs test i DBS eluater (modificeret fra17). ROC-styrede stigningen af cut-off værdi for HBsAg kvantificering fra 0,05 IU/ml (A) til 0,15 IU/ml reduceret (B) sats i falsk-positive resultater fra 14,7% til 0%. På samme måde, ROC analyse af anti-HBs koncentrationer foreslået en nedsættelse af de respektive tærskel fra 10 IU/l (C) til 1,5 IU/l (D), derved helt eliminere falsk-negativer, som oprindeligt udgjorde 14,2% af alle bestemmelser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
Koblede serum/DBS analyseresultater er sammenfattet i tabel 117. Ingen manglende specificitet blev indspillet i løbet af DBS testning for nogen af de syv analysander.
Når DBS eluater blev undersøgt for tilstedeværelse af HBsAg, i. e. serologiske vigtigste parameter for både akut og kronisk infektion med HBV, blev der fastsat en analytisk følsomhed på 98,6%. HBsAg koncentrationer i de to falsk-negative sera blev 749 IU/ml og 6 IE/ml, henholdsvis. Anti-HBc antistoffer blev korrekt registreret i 176 ud af 204 (i. e 86.3%) DBS eluater. Toogtyve ud af 28 enhederne, som ikke var blevet opdaget af målingerne stammer fra enkeltpersoner co-inficerede hiv. Således, hvis HIV-positive personer blev udelukket fra beregningen, en følsomhed på 97,1% blev opnået til hentning af anti-HBc antistoffer fra elueret tørrede hele venøse blod. Lignende observationer var tilfældet for bestemmelse af anti-HBs antistoffer. Selv efter justering af cut-off værdi af analysen til 1,5 IU/l opstod ni afvigende serum DBS resultaterne. I patienter ikke co-inficerede hiv, fandtes anti-HBs serumkoncentrationer af 11-26 IU/l, som var for lavt til at tillade registrering efter eluering af de tørrede blod.
Anti-HCV antistoffer er vejledende for enten en akut eller kronisk eller løst infektion. Kun fire (i. e. 2,2%) falsk-negativ anti-HCV resultater blev bestemt ud fra DBS eluater og yderligere serologiske og molekylære analyser klart demonstreret, at de respektive sera meget sandsynligvis blev taget fra patienter, hvis infektioner havde længe siden været løst.
Anti-HIV antistof i DBS eluater med fuldautomatisk system var en helt glat proces, der gav en analytisk følsomhed på 100%.
"Mean HBV DNA koncentration fra fuldblod eluater blev udført på 100 enheder (betyder DNA koncentration: 1,573,898 IE/ml, range: < 357 - > 17,860,000 IE/ml) og givet en værdi af 93,0%. Således blev syv prøver med lave serumkoncentrationer HBV DNA mellem 409 og 3,643 IE/ml ikke opdaget af DBS test. Af 100 sera, som havde vist sig for at være HCV RNA positive (betyde HCV RNA koncentration: 1,415,944 IE/ml, rækkevidde: 2,479 - > 7,692,000 IE/ml), tilsvarende fuldblod delprøver var til rådighed. Den sammenlignende undersøgelse resulterede i en analytisk følsomhed på 100% til HCV RNA bestemmelse fra DBS eluater." 17
For at teste den skitserede protokol for forberedelse og forarbejdning DBS under markforhold, blev det brugt i tæt samarbejde med Robert Koch-Institut (Berlin, Tyskland) i pilotfasen af undersøgelsen "Narkotika og kroniske infektionssygdomme", som var gennemført på aktive stofbrugere i de tyske byer i Berlin og Essen18. Alle 534 deltagere, indskrevet (433 mænd og kvinder, 101) gennemgik kapillær blod prøveudtagning som beskrevet i detaljer i afsnit 2.2.1 – 2.2.3 i den foregående protokol, og DBS var, igen, elueres ved tilsætning af 1.000 µl af PBS-baseret buffer.
To personer blev diagnosticeret til at være kronisk inficerede med HBV, og 39 viste den serologiske mønster af et løst HBV-infektion. Derudover 15 deltagere var positive for anti-HBs (status efter vaccination) og otte fandtes for at være positiv for anti-HBc alene. Anti-HCV-prævalensen blandt deltagerne var 57,3% (N = 193) i Berlin og 73.0% (N = 144) i Essen. Fra antistof-positive prøver 65% (N = 125) og 62% (N = 89) var også viræmiske. Tyve-fem ud af de 534 personer testet positiv for anti-HIV. Nitten af infektionerne var allerede kendt og 24 af disse personer var Co inficeret med HCV.
Resultaterne af DBS test blev omhyggeligt sammenlignet med undersøgelsens deltagere anamnese data om selvrapporterede HBV og HCV status. Denne sammenligning sammenholdt med resultaterne af afprøvning kombineret serum/DBS par ført til mindre ændringer af test algoritme til den vigtigste fase af "DRUCK Study", som vil tilmelde aktive stofbrugere i seks ekstra store tyske byer: "personer smittet med HIV altid vil testes for tilstedeværelse af HBV DNA. Deltagerne hvis DBS eluater er positive for anti-HBc eller anti-HBs bør underkastes en venepunktur under en anden konsultation skal absolut klarlægge deres anti-HBc/anti-HBs status og, endelig, alle DBS eluater vil blive screenet for HCV RNA Uanset resultaterne af anti-HCV test." 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>Parametre</td>
			<td>Koblede sera/DBS eluater (N)</td>
			<td>Afvigende resultater (N)</td>
			<td>Årsag til afvigelser mellem forsøg serum og DBS eluater</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>To patienter med kronisk HBV infektion. Begge var under antiviral behandling og en af dem var Co smittet med HIV. HBsAg koncentrationer i serum: 749 IU/ml og 6 IE/ml, henholdsvis.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>I serum havde tyve-to patienter en løst HBV-infektion. Seks personer viste serologisk fund "anti-HBc alene". Tyve-to af patienterne var Co smittet med HIV. Fra "HBV resolvere", tyve blev vurderet som "Anti-HBs positive alene" af DBS test og således blev fejlagtigt klassificeret som "tilstand efter vaccination".</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>De fire patienter ikke co-inficerede HIV havde anti-HBs serumkoncentrationer af 11 ‑ 26 IU/l, som var for lavt til at muliggøre påvisning af antistof efter eluering af de tørrede blod pletter.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>De respektive sera havde opnået fra syv patienter med lavt serum HBV DNA koncentrationer spænder fra 409 IU/ml til 3,643 IU/ml.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HCV</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>Disse fire sera havde taget fra patienter med længe siden løst HCV infektioner.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV-RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV 1-p24/anti-HIV 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Resultaterne fra 1,762 DBS, der blev tilberedt og forarbejdet fra hele veneblod følgende protokollen foreslås i denne meddelelse, i forhold til resultaterne i koblede serumprøver som reference.

Watch this Scientific Journal Video about Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques at JoVE.com

Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

Forberedelse og forarbejdning af tørret blod pletter (DBS) for deres endelige analyse er stadig dårligt standardiseret for de fleste diagnostiske programmer. For at overvinde denne mangel, er en omfattende trinvise protokollen foreslog og efterfølgende evalueres med hensyn til dens effektivitet til påvisning af markører for virusinfektioner.

Tørrede blod pletter - forberedelse og forarbejdning til brug i immunassays og molekylærbiologiske teknikker

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gør-det-selv enhed for inddrivelse af Kryopræserverede Prøver uheld faldt i Kryogene lagertanke

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Ikke-Terminal blodprøvetagning teknikker i marsvin

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionel Opløsning og kanalaktivitet Målinger af renset Vildtype og Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker til analyse af ekstracellulær Vesikler anvendelse af flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Gentagen Blodprøvetagning for blodprøver Voksen Zebrafisk

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Forsamlingen og anvendelse af &#39;Shear Rings &quot;: A Novel Endothelial Model for Orbital, ensrettet og periodisk Fluid Flow og Shear stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-skala fænotyper teknikker af majs kardiovaskulære bundter baseret på X-ray Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...