Name: dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques
Uploaded: 2015-03-13T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques at JoVE.com

Denne meldingen er basert på resultatene tidligere publisert i virologi Journal17 i åpne-tilgangsmodus under betingelsene i Creative Commons Attribution License (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) med BioMed Central som en Lisenstaker. Forfatterne takknemlig anerkjenner fruktbart samarbeid i rammen av pilotering studien "Narkotika og kronisk smittsomme sykdommer" ("DRUCK studere") med U. Marcus, W. Cai, W. Zhang og R. Zimmermann fra Robert Koch-instituttet (Berlin, Tyskland) og er takknemlig til S. Moyrer for tar bildene samlet i figur 1 samt om D. F. Whybrew, Ph.D, (Göttingen, Tyskland) for å korrigere det manuskriptet. De også uttrykke sin takknemlighet for dyktige kundestøtte J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, M. Schröter og K. Seidel. Denne studien var støttes delvis av et tilskudd på tysk Helsedepartementet nasjonale referanse sentrum for hepatitt C.

Siden protokollen er utformet for bruk i medisinsk diagnostikk, må anvendelsen følge prinsippene i Helsinkideklarasjonen19. For den første delen av resultatene som presenteres i denne kommunikasjon, både en separat avtale av pasientene og godkjennelse fra en etisk komite syntes å være unnværlig for to grunner: (1) "etter opptak" til Essen universitetssykehus, "hver pasient gir skriftlig samtykke til alle nødvendige biokjemiske bakteriologiske og virological undersøkelser." 17 (2) "alle prøver brukes i evalueringen av DBS testing ble sendt til Institute of Virology under rutinemessige klinisk diagnostikk. Dermed ingen av de innsamlede å studien, ikke en enkelt ytterligere venipuncture ble utført, og ingen av materialene ble testet for alle typer parametere enn de som kreves av leger i løpet av normal diagnostiske utredning." 17 studien "Narkotika og kronisk smittsomme sykdommer" (DRUCK studere")18, der DBS testing ble til slutt brukt i tyske byene i Berlin og Essen for å vurdere folk som aktivt injiserer narkotika, ble godkjent av Federal kommissær for Data Beskyttelse og frihet av informasjon (Berlin, Tyskland) og også ved den etiske komiteen av de medisinske universitet Charité, (Berlin, Tyskland).
1. innsamling av blod
<ol><li>Venipuncture14, 15, 20, 21<ol>
<li>Sett på disponibel latex gummihansker, og rense området på tiltenkte punktering området (fortrinnsvis median cubital fotsporene i antecubital fossa) med en passende desinfeksjonsmiddel, f.eks, 70% isopropylalkohol.</li>
		<li>Bruk en tourniquet 4-6 inches over webområdet antatte punktering å distend venene. Guide nålen inn pasientens blodåre, og når det er på plass, forsiktig fylle tilkoblede blod røret, som inneholder EDTA som en antikoagulerende.</li>
		<li>Så snart venipuncture er fullført, frigi tilstrammende og trekke nålen. Deretter trykk en tørr gauze pute på området punktering, som senere kan holdes på plass av en bandasje.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hud punktering (figur 1A)13-15, 20, 22, 23<ol>
<li>Sette på et par av disponibel latex gummihansker.</li>
		<li>Før hud punktering, bør pasienten varme sine hender. Fingeren er massert anterogradely rikere blodstrømmen mot for å punktere området.</li>
		<li>Rengjøre huden av palmar siden av tips distale falanks av tredje eller fjerde fingeren ikke skriving hånden med egnet desinfeksjonsmiddel, f.eks, 70% isopropylalkohol. Punktering huden ved å bruke én sikkerhet lancet. Fingeren skal holdes i en slik stilling at tyngdekraften muliggjør innsamling av blod på fingertuppen.</li>
		<li>Når samling av kapillær blod av hud punktering er fullført, kan du plassere en bandasje på fingeren tips.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. utarbeidelse av blod flekker
<ol><li>Forberedelser fra blod samles inn av venipuncture15<ol>
<li>Spot samlet anti-koagulert (EDTA) hele venøst blod på filteret kortene så snart som mulig. Ikke forberede tørket blod flekker mer enn 24 timer etter venipuncture.</li>
		<li>Lagt all informasjon nødvendig for identifikasjon av pasienten på filterkortet. Ett kort bør bli sett bare med blodet av en enkeltperson.</li>
		<li>Sette på disponibel latex gummihansker.</li>
		<li>Forsiktig Inverter blod samling rør 2-4 ganger og deretter åpne stopperen nøye.</li>
		<li>Sug opp 50 µl av hele venøst blod bruker en pipette med disponibel tips. Overføre blodet til midten av en sirkel uten å berøre filter papir direkte med spissen av pipette. Prøv å fullt mette sirkelen.</li>
		<li>Gjenta denne fremgangsmåten for å fylle alle nødvendige sirkler av kortet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelser fra blod samles inn av hud punktering (tall 1B og 1 C)13-16, 23<ol>
<li>Tørk av den første blodsdråpe med en gauze pute fordi det kan inneholde overflødig vev væske. Massasje fingeren igjen for å øke blodstrøm på webområdet punktering. Overføre følgende drop til én av sirklene filter kort uten å berøre overflaten direkte med fingertuppen. Tillat blodet flommet inn i teksturen i filteret av kapillære krefter bare.</li>
		<li>La neste stor dråpe kapillær blod skjemaet på finger-spissen og samle den i neste sirkelen. Fortsett med denne fremgangsmåten til alle nødvendige sirkler fylt eller blodstrøm stopper.</li>
		<li>Ikke klem eller "melk" finger overdrevet hvis blodstrøm ikke er tilstrekkelig til å fylle alle de nødvendige sirklene av filterkortet. Hvis blodstrøm stopper sette en bandasje på finger-spissen. Utføre en andre hud punktering på en annen finger hvis mer blod er nødvendig for eksamen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. tørking av blod flekker
<ol><li>For å tørke blod flekker, sette filteret på et rent papir håndkle i en farlig biologisk sikkerhet regjering og la dem tørke, fortrinnsvis O/N (men for minst 4 timer), på RT i fravær av noen ekstern kilde av varme. Når tørking prosessen er fullført, blod flekker har en jevnt mørk brun farge og ingen røde er synlige lenger (figur 1 d)13, 15, 16.</li>
</ol>4. lagring og transport av tørket blod flekker (DBS)
Merk: Behandling av blod flekker kan avbrytes etter tørking. Filteret kortene kan nå være lagret13-16, 23.
<ol><li>For lagring, sette filter papir kortet i en enkelt, gass-ugjennomtrengelig glidelås bag, som inneholder 1 til 2 tørkemiddel poser for å beskytte de fra fuktighet (figur 1E). Du kan også legge til en fuktighet indikator kort.</li>
	<li>Overføre denne vesken til en fryser med en temperatur på 20 ° C eller lavere så snart som mulig. Hvis frysere ikke er tilgjengelig under feltforhold, er lagring på 4 ° C eller til og med romtemperatur mulig i opptil 14 dager.</li>
	<li>Transport frosne DBS prøver på tørris. For filteret kort først holdt ved omgivelsestemperatur, bruker du en trippel pakkesystemet, som består av glidelås bag (r) som den indre container(s) samt en indre og en ytre konvolutt. Ingen innhold tegninger kreves på den ytre konvolutten for levering via vanlig post, men må festes internasjonale biohazard symbol primære indre beholder16.</li>
	<li>Utelukke filter kortene fra videre behandling hvis de tørkemiddel emballere og/eller ekstra fuktighet indikator kortet endres til en rosa farge.</li>
</ol>5. elueringsrør tørket blod flekker13, 15, 16, 23
<ol><li>Slå ut ett sted med en engangs 6 mm enhet fra hver blod-gjennomvåt sirkel av klasse 903 filterkortet (figur 1F). Overføre alle slo tørket blod flekker fra en enkelt pasient i en brønn av 12-vel plate.</li>
	<li>Fyll brønnen med fosfat-bufret saltvann inneholder 0,05% mellom 20 og 0,08% Natriumazid (figur 1G). Tilpasse volumet av legges buffer til de respektive minimumskrav til analysen brukes for påfølgende analyse av tørket blod flekker eluates.</li>
	<li>Gjenta disse trinnene for å få et sekund serie av tørket blod flekk eluates for å utføre molekylær analyser.</li>
	<li>Sett celle kultur plate på en laboratorium shaker og la stemplet tørket blod flekker forsiktig elute minimum 4 timers eller O/N (figur 1 H).</li>
	<li>Neste dag, stedene er nesten fri for blod og Hemolytisk supernatants har dannet (figur 1I). Overføre disse eluates til microcentrifuge rør. Deretter gitt dem til sentrifugering i 2 minutter på 10500 x g (figur 1J) gratis supernatants fra rusk hadde dannet under elueringsrør (figur 1 K).</li>
</ol>6. analyse av Eluates
<ol><li>Sentrifugeres eluates er nå klar til å brukes for de tiltenkte analysene. Undersøke eluates for markører for hepatitt B-viruset og hepatitt C-viruset HIV-smitte bruke kommersielt tilgjengelige kits og følger den aktuelle produsentens instruksjoner nøye (figur 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> Figur 1. Grafisk sammendrag av protokollen foreslått i denne kommunikasjonen for forberedelse og behandling av tørket blod flekker som skal brukes i immunanalyser og molekylære teknikker. Hele venøst blod og kapillær blodstrøm innhentet av enten venipuncture eller punktering av huden ved lancet (A) kan tjene som prøver for tørket blod flekk analyse. Etter overføring av blodet til sirkler Grade 903 filter kort (B, C), må prøvene tørkes fortrinnsvis O/N ved omgivelsestemperatur i en farlig biologisk sikkerhet regjering til skjemaet Plasser et jevnt brun farge uten noen interspersion rød områder (D). Når tørking av blod flekker er fullført og lagring er nødvendig filter kortene kan pakkes i gass-ugjennomtrengelig glidelås poser som inneholder 1 – 2 tørkemiddel poser (E). Ytterligere laboratorium behandling av DBS omfatter generering av slag av en 6 mm voksen enhet fra midten av sirklene (F, G), tilsettes slag i en PBS-baserte buffer for minimum 4 timers eller O/N på en shaker (H ), utvinning av eluates (jeg), og til slutt sentrifugering laboratorium kopper (J) å ledig DBS eluates fra rusk kan ha sin opprinnelse i elueringsrørets prosessen (K). Deretter er DBS eluates klar for analyser, som ble utført av en helautomatisk plattform (L) for å oppdage serologisk markører for HBV og HCV HIV-infeksjoner, henholdsvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Tidligere mottatt RSR en honorarium for å levere forelesninger og økonomisk støtte for sitt vitenskapelige arbeid fra Abbott diagnostikk. NG og OM erklærer at de har ingen motstridende interesser.

DBS er brukt for 100 år2 , men overraskende, det er fortsatt ingen generell enighet om sine forberedelser og behandling. Hittil har en tilstrekkelig standardisering av denne viktige pre analytisk fasen bare blitt oppnådd innen nyfødt screening14, mens en rekke forskjellige protokoller finnes for alle andre programmer av DBS testing5, 16, 23. For å overvinne dette bemerkelsesverdige heterogenitet, er en omfattende trinnvis instruksjon for utarbeidelse og behandling DBS som skal benyttes i immunanalyser og molekylære teknikker presentert i denne kommunikasjonen og evalueres med hensyn til dens effektivitet for å oppdage markører for HBV og HCV HIV-infeksjoner. Fokus for følgende diskusjonen er primært plassert på de ulike trinnene i det foreslåtte protokollen.
I historien om DBS teste mange forskjellige filter papir kortene har vært brukt2 men i dag bare to kommersielle kilder er godkjent av FDA som klasse II medisinsk utstyr for blod samling5, 16. Disse filtersystemer kort er svært jevn og har svært like vannabsorpsjon egenskaper slik at analytisk resultatene fra kapillær blod forberedt på en av dem ikke avviker med mer enn 4%-5%28. Ikke overraskende, Masciotra og kolleger29 derfor oppdaget HIV-1 RNA like godt med en kvalitativ analyse etter elueringsrør fra blod samling kort fra ulike kilder. Gitt disse dataene, kan det nesten utelukkes at noen av avvik observert når testing kombinert serum/DBS par for markører for hepatitt b, hepatitt c og HIV infeksjoner17 ble forårsaket av filterkortet alene. Men når nøyaktig kvantifisering av en analytt er uunnværlig kilde til kildevariasjonen ikke lenger være ubetydelig og mer avanserte teknikker, f.eksperforert DBS (pdb-er) for å microsampling30 eller forberedelse tørket serum flekker må (DSS)31 brukes i stedet for konvensjonelle DBS testing10.
Siden bare små mengder av blod brukes for DBS testing (en dråpe kapillær blod består av ca. 50 µl)5, 16, variasjoner i prøven volumet er avgjørende, og riktignok på minst noen av avvik mellom serologisk resultater og deltakerens egenrapporterte HBV og HCV-status under føring av "DRUCK studien" er knyttet til denne variabelen. Den viktigste faktoren for å minimere "kursbevgelsene" av prøven er utvilsomt en riktig kapillær blod samling, som bare kan oppnås av forsiktig og kontinuerlig opplæring av de tekniske personell22. Som et mål på kvalitetskontroll, bør alle laboratorier arbeider med DBS ha allerede innviet prosedyrer for identifisering og deretter ekskludere DBS prøver som må vurderes utilfredsstillende eller ugyldig16.
Studier gjennomført i sammenheng med HIV32 og nyfødt screening33 har vist at høy luftfuktighet kan føre til en degradering av analytter, men hittil ingen konsensus er nådd om spørsmålet om hvor lenge DBS skal lufttørket . Et intervall på minst 4 t eller helst O/N foreslås i denne kommunikasjon, som derfor vedtatt forholdene som ble brukt i det store flertallet av alle relevante publikasjoner32, 34 på lagring av DBS skal brukes senere for HBV og HCV testing er i konflikt. I 1981, Villa og kolleger35, som brukt moderne analytiske teknikker, rapporterte at lagring på RT ikke påvirke resultatene av HBV analyser i hele observasjon løpet av 180 dager hvis antistoff titers > 1/1000, men at DBS ble borderline-positive eller negative selv etter 15 dager da titers i serum var bare 1/100. Lagring på 20 ° C eller 4 ° C resulterte ikke i en betydelig forbedring. Derimot en studie utført tretti år senere36 testet gjentak av HBV-positive en prøve, og forfatterne funnet at anti-HBc så vel som anti-HBs antistoffer var stabile i opptil 183 dager på RT, mens HBsAg oppstiller ble USANN-negativ allerede etter 63 dager. Med hensyn til HBV DNA oppdagelsen fra DBS eluates, konsentrasjonen av viral nukleinsyre var stabil i minst syv dager på 37 ° C37 eller viste "motstandsdyktig" til lagring på RT tre uker38. Testing for anti-HCV-antistoffer bruker to kommersielt tilgjengelig tredje generasjon immunanalyser39 gitt nøyaktige resultater for 117 dager DBS utvalg lagret på 20 ° C, 2-8 ° C og 20-25 ° C, henholdsvis. Lagring på 20 ° C, men resulterte i laveste varianten av optisk tetthet. Bruke en fjerde generasjon anti-HCV ELISA, dvs Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, i sammenheng med DBS testing, Larrat et al. 40 observert en skarp nedgang i analytisk spesifisitet når de DBS prøvene i mer enn tre dager på RT. På den annen side, ble presise testing resultater oppnådd med samme kit utnytte prøver avsatt i 60 dager under ulike forhold (20 ° C, 2-8 ° C og 22-26 ° C) av Brandao og kolleger41. Observasjoner på tilbakegang for HCV RNA i DBS under ulike lagringsforhold varierer fra ingen betydelig endring på RT for opptil ett år42 til en tidoblet etter fire uker omgivelsestemperatur43. Ta denne ganske motstridende data på stabiliteten av HBV og HCV antigener, atomer syren og antistoffer hensyn, virket det fornuftig å trekke i foreslåtte protokollen til en konsensus, som ble definert tidligere for lagring av DBS brukes til HIV-testing15, 30: til kortsiktige deponering (opptil to uker) antigener og viral nukleinsyre antistoffer regnes som stabil på RT, mens optimal lagring for lengre perioder på frosne forhold.
Som regel tre parametere bør vurderes når du utformer en elueringsrør protokoll: (1) elueringsbufferen; (2) varighet og temperaturen i elueringsrørets; og (3) elueringsrør volum23. I det store flertallet av alle relevante publikasjoner fosfat-bufret saltvann (PBS) ble brukt for eluting DBS, og de fleste forfattere lagt et protein, f.eks, storfe serum albumin (BSA) eller mellom 20, avspenningmiddel, for å forbedre analysen signalet ved å stabilisere proteiner, som de går, og samtidig blokkerer uspesifisert bindende områder23. Bare noen rapporter, som direkte sammenligner forskjellige elueringsrør buffere i sammenheng med DBS testing, er tilgjengelige. Villar et al. 36, f.eksregistrert nesten tilsvarende elueringsrør kapasiteter for alle buffere brukt, men PBS/BSA 0,5% førte til det laveste nivået på uspesifisert reaktivitet. En svært lik observasjon ble gjort av Croom og kolleger44 når du bruker prøvefortynner av genetikk systemer rLAV EIA for tilsettes av anti-HCV-antistoffer fra DBS. Siden risikoen for eksempel fornedrelse er svært lav i de første timene etter utarbeidelse av DBS (se ovenfor), ble det besluttet å ruge flekker O/N ved omgivelsestemperatur og støtte elueringsrør prosessen ved å forsiktig over-gjennomgående blande. Dette har fordelen at prøver slo den forrige dag kan direkte overføres til rutinemessig diagnostikk tidlig neste morgen23. Volumet av elueringsbufferen bør være tilpasset de respektive minimumskrav av analyser brukes for senere analyser for å holde fortynningsfaktoren for så lavt som mulig. Men var en forsiktig optimalisering av elueringsrør betingelsene for hver enkelt analytt ikke mulig i foregående evalueringen fordi en høy eksempel gjennomstrømning måtte garanteres på forholdsvis kort tid under "DRUCK Study"17. Derfor ble heller ugunstige volumet av 1000 µl PBS-baserte bufferen brukt for å fullføre hele elueringsrør for alle parametere i to separate operasjoner.
Denne tilnærmingen en ene mislykkes "helt i anti-HBc/anti-HBs systemet for personer smittet med HIV på grunn av de lave antistoff konsentrasjonene; ... og det kreves molekylær biologiske prosedyrer med optimal analytisk følsomhet med hensyn til HBV DNA og HCV RNA tester. " 17 derimot, høy elueringsrør volumet viste skal på ingen måte ugunstig for fastsettelse av HBsAg, anti-HCV og anti-HIV av settene brukes i evalueringen. "Gjenkjenning av HBsAg positiv materiale fra fullblod eluates lyktes med en følsomhet på 98.6% til en tilsvarende høy grad i tidligere studier som hadde delvis brukt et mye mindre elueringsrør volum 100 µl, 250 µl, eller 600 µl eller 500 µl"17 ,36, 45, 46. Følsomheten til 97.8% bestemmes i etterforskningen av 179 serum/DBS for anti-HCV-antistoffer tilsvarte resultatene av allerede eksisterende rapporter24, 44, 47, 48, 49, som hadde jobbet med et elueringsrør volum som var lavere med en faktor på 5 til 10. "I tillegg protokollene for anti-HCV oppdaging hadde vært riktig optimalisert... av fastsette egne cut-off poeng"17, 24, 48, 49 "eller ved å øke utvalget volumene fra 20 µl til 100 µl." 17: 49 endelig den analytiske spesifisitet og følsomhet (100% hver) etablert for anti-HIV gjenkjenning var lik eller bedre enn ytelsesegenskapene til andre immunanalyser spesielt tilpasset DBS testing50, 51 "eller en gradvis prosedyre med kombinert bruk av flere anti-HIV tester"17,52. "De faktisk også overskredet resultater posten av analysen som ble spesielt utviklet og optimalisert for påvisning av anti-HIV antistoffer i DBS eluates (Q-hindre HIV-1 + 2 DBS kit)." 17, 53  
Samlet omfattende trinnvis protokollen presentert i dette viste seg for å være en mulig og brukervennlig verktøy for utarbeidelse og behandling DBS og kan dermed brukes pålitelig i diagnostiske virologi. Den lar tilnærminger bruke automatisering 54 og på grunn av gode resultatene egenskaper har potensial til å tjene som en slags grunnsteinen for en fremtidig allment aksepterte konsensus protokollen innen globale DBS testing i laboratorier medisin.

Ideen om å bruke blod samlet på et papir kort laget av cellulose er tilskrevet Ivar Christian Bang (1869-1918), far til moderne klinisk microanalysis1, 2. I 1913, bestemt Bang glukose fra eluates av tørket blod flekker (DBS)3 og senere også nitrogen målinger med metoden Kjeldahl med denne filter papir teknikk2. Deretter flere etterforskere rapporterte om bruk av DBS for serologisk testing for å diagnostisere syfilis2. Så tidlig som i 1924 Chapman oppsummert fordelene DBS testing når han spesielt understreket fire elementer, som er gyldig i dag: (1) sammenlignet med konvensjonelle venipuncture, mindre blodvolum kreves, og dette faktum var viktigst i pediatric diagnostikk; (2) blod samling er enkelt, ikke invasiv og billig; (3) risiko for bakteriell forurensning eller hemolyse er minimal. og (4) DBS kan bevares i lange perioder med nesten ingen forverring av analytter2, 4. Foruten dets bruk i testing for syfilis, ytterligere tidlig programmene av DBS teknikken inkludert, f.ekspåvisning av antistoffer mot meslinger, kusma, poliovirus, parainfluensa virus og respiratorisk syncytial virus (RSV) i 19532 Identifikasjon av Shigella i avføring tørket på filter papir og sendt med vanlig post fra Indonesia til Leiden i Nederland samt gjenkjenning av antistoffer mot Schistosoma i DBS i endemiske områder og analysert mer enn tre måneder senere5 . I 1963 publisert femti år etter Bang opprinnelige kommunikasjon2, 6, Guthrie endelig sin berømte metode for diagnostisering av Fenylketonuri fra DBS ved hælen drittsekk fra nyfødte7, 8.
Men fra den tiden fremover, DBS ble betraktet som vanligvis gjelder for innsamling, lagring og transport og analysere en rekke menneskelige kroppsvæsker5, deres bruk i diagnostikk forble hovedsakelig fokusert på diagnostisering av infeksjoner spesielt i ressurs-begrenset innstillinger og systematisk screening av nyfødte for arvet metabolske forstyrrelser for tiår9, 10. Siden 2005 har imidlertid en rekke nye og innovative DBS programmer har begynt å dukke. Dette resulterte i en nesten eksponentielle økning i antall respektive vitenskapelige publikasjoner på DBS fra ca 50 til nesten 450 årlig i dag. Blant de nye programmene er slike varierte felt som toxico og farmakokinetiske studier, metabolske profilering, terapeutisk medikament overvåking, rettsmedisinske toksikologi eller miljøforurensning kontroll10, 11.
DBS testing har dermed gjort en triumphal marsj gjennom clinical laboratory diagnostikk under siste 100 år2. Som klinisk kjemi12, men var under denne mars pre analytisk variabler ikke tilstrekkelig vurdert i mange år. Faktisk, selv i dag, etter eminente aktiviteter som CDC'S filter papir evaluering prosjektet13 eller utformingen av en nasjonal standard for blod samling på filter papir i rammen av nyfødt screening14, pre analytisk fasen er fortsatt i stor grad undervurdert i de fleste av de andre feltene, der DBS testing er brukt5 og 10.
Gitt denne bakgrunnen, en omfattende trinnvis protokoll14-16 for bruk i immunanalyser og molekylære teknikker, som dekker alle de grunnleggende trinnene, foreslås for utarbeidelse og behandling DBS i følgende åpenbaring: (1) samling av blod. (2) utarbeidelse av blod flekker; (3) tørking av blod flekker; (4) lagring og transport; (5) elueringsrør av DBS; og til slutt (6) analyser av DBS eluates. Effektiviteten av protokollen ble først vurdert med 1,762 kombinert serum/DBS parene for å avdekke hepatitt B-viruset (HBV) overflate antigen (HBsAg), antistoffer mot HBV kjerneantigen (anti-HBc), antistoffer mot HBV overflate antigen (anti-HBs), HBV DNA, antistoffer for hepatitt C-viruset (HCV) (anti-HCV) HCV RNA og humant immunsviktvirus (HIV) 1-p24-antigen/anti-HIV 1/2 en helautomatisk plattform eller sensitive kvalitativ nukleinsyre tester. 17. i andre trinnet, protokollen ble benyttet i pilotstudie "narkotika og kronisk smittsomme sykdommer" ("DRUCK studere") som er utført av det Robert Koch-instituttet i nært samarbeid med de nasjonale referanse for hepatitt C på aktiv narkotikabrukere i de tyske byene i Berlin og Essen18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Latex rubber gloves</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#4049500041515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td>#9768050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulifly safety cannula</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#85.1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA blood collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#02.1066.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#2994163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry gauze pad</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#143213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singel-use safety lancet</td>
			<td>Owen Mumford</td>
			<td>#3802421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Card</td>
			<td>Whatman/sigmaaldrich</td>
			<td>#10534612</td>
			<td>Filter paper card Grade 903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>#S1126-7810, #S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper bag</td>
			<td>Flexico</td>
			<td>#20219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini desiccant bag</td>
			<td>Tropack</td>
			<td>#-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Punch</td>
			<td>pfmmedical</td>
			<td>#48601</td>
			<td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Forceps</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>#H7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A1389.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#66880250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HBsAg (Qunatitative)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBc II</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#8L4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBs</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#7C1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HCV</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#4J2727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#6374891001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artus HBV LC PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td>#2554311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

Ideen om å samle blod på et papir og deretter bruke de tørkede blod flekkene (DBS) for diagnoseformål stammer århundre siden. Siden da DBS testing for tiår har vært hovedsakelig fokusert på diagnostisering av smittsomme sykdommer spesielt i ressurs-begrenset innstillinger eller systematisk screening av nyfødte for arvet metabolske forstyrrelser, og bare nylig har en rekke nye og innovative DBS programmer begynt å dukke. I mange år, pre analytisk variabler var bare upassende vurdert i feltet DBS testing og selv i dag, med unntak av nyfødte screening, hele pre analytisk fasen, som består av utarbeidelse og behandling av DBS for deres endelige analysen blitt ikke standardisert. Gitt denne bakgrunnen, foreslås en omfattende trinnvis protokoll, som dekker al avgjørende faser, dvs. samling av blod. utarbeidelse av blod flekker; tørking av blod flekker; lagring og transport av DBS; elueringsrør DBS, og til slutt analyser av DBS eluates. Effektiviteten av denne protokollen ble først evaluert med 1,762 kombinert serum/DBS parene for å avdekke markører for hepatitt B-viruset hepatitt C-virus og humant immunsviktvirus infeksjoner på en automatisert analytisk plattform. Under det andre trinnet, ble protokollen benyttet under en pilotstudie, som ble gjennomført på aktive narkotikabrukere i de tyske byene i Berlin og Essen.

Effektiviteten av protokollen foreslått for utarbeidelse og behandling av DBS ble først vurdert ved å analysere 1,762 kombinert serum/DBS par for markører HBV og HCV HIV-infeksjon. 17. for dette formålet, DBS var forberedt fra 100 µl hele venøst blod (jf punkt 2.1.1-2.1.6 foregående protokollen) og var elut med 1000 µl av PBS-baserte buffer, hver, (jf poeng 5.1-5.5 nevnte protokollen) for å fullføre prosessen for alle syv parametere i to separate operasjoner. En slik tilnærming uten forsiktig optimalisering av elueringsrør betingelsene for hver enkelt analytt syntes å være uunngåelig fordi en ganske høy utvalg ytelse var forventet på forholdsvis kort tid i løpet av kommende feltet studie "narkotika og kronisk Smittsomme sykdommer"("DRUCK Study").
Alle mål overholder produsentens anbefalinger i DBS analyser, men måtte endres med hensyn til HBsAg og anti-HBs bestemmelser å kompensere for effekten av hemolyse eller resultatet av fortynning. Med cut-off verdien 0,05 IU/ml, HBsAg testing av DBS eluates føre til et antall falske positiver 14,7% (52 av 354) i forhold til serum prøver (figur 2A). Få fungerer karakteristiske (ROC) analyse25, 26 data indikerte at en økning på terskelen til 0,15 IU/ml, vil føre en ideell separasjon av HBsAg-positive fra HBsAg-negativer (0.986 [følsomhet], 0.000 [1-spesifisitet], Figur 2B). På den annen side, med en cut-off av 10 IU finans for kvantifisering av anti-HBs registrert antistoffer en rate av false negativ målinger 14.2% (47 av 331) var (figur 2C). Derfor, etter ROC analyse igjen, denne cut-off ble senket til 1,5 IU/l å oppnå en optimal diskriminering av verdier (0.917 [følsomhet], 0.007 [1-spesifisitet], figur 2D).
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> Figur 2. HBsAg og anti-HBs testing i DBS eluates (endret fra17). ROC-guidede økningen av cut-off verdien for HBsAg kvantifisering fra 0,05 IU/ml (A) til 0,15 IU/ml redusert (B) antall falske positive resultater fra 14,7% til 0%. Tilsvarende foreslo ROC analyse av anti-HBs konsentrasjoner en nedgang på respektive terskelen fra 10 IU/l (C) til 1,5 IU/l (D), og dermed fullstendig eliminere falske-negativer, som opprinnelig stod for 14.2% av alle bestemmelser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
Resultatene av kombinert serum/DBS analysene oppsummeres i tabell 117. Ingen ikke-spesifisitet ble spilt inn i løpet av DBS testing av de syv analytter.
Når DBS eluates ble undersøkt for tilstedeværelsen av HBsAg, IE serologisk Nøkkelparameteren av både akutt og kronisk infeksjon med hepatitt b, identifiserte en analytisk følsomhet på 98.6%. HBsAg konsentrasjonene i de to feilaktig-negativ sera var 749 IU/ml og 6 IU/ml, henholdsvis. Anti-HBc antistoffer oppdaget ble i 176 av 204 (i. e 86.3%) DBS eluates. Tjueto av de 28 prøvene som ikke ble oppdaget av målinger fra enkeltpersoner co smittet med HIV. Dermed, hvis HIV-positive personer ble ekskludert fra beregningen, en følsomhet på 97,1% ble oppnådd for å hente anti-HBc antistoffer fra elut tørket helt venøst blod. Lignende observasjoner holdt sant for fastsettelse av anti-HBs antistoffer. Selv etter justering av cut-off verdien av analysen til 1,5 IU/l oppstod ni discrepant serum DBS resultater. I pasienter ikke co smittet med HIV, ble serum anti-HBs konsentrasjoner av 11-26 IU/l funnet, som var for lavt til å tillate søking etter elueringsrør tørket blod.
Anti-HCV-antistoffer er tegn på en akutt eller kronisk eller løst infeksjon. Bare fire (i. e. 2.2%) feilaktig-negativ anti-HCV resultatene var bestemt fra DBS eluates og videre serologisk og molekylære analyser tydelig demonstrert at de respektive sera trolig ble tatt fra pasienter, som infeksjoner hatt forlengst løst.
Gjenkjenning av anti-HIV antistoffer i DBS eluates med helautomatisk system var en helt jevn prosess som hadde en analytisk følsomhet på 100%.
"Betyr HBV DNA konsentrasjonen fra fullblod eluates ble utført på 100 eksemplarer (mener DNA konsentrasjon: 1,573,898 IU/ml, range: < 357 - > 17,860,000 IU/ml), og ga en verdi på 93.0%. Dermed ble syv prøver med lav serum HBV DNA konsentrasjoner mellom 409 og 3,643 IU/ml ikke oppdaget av DBS testing. Av 100 sera som hadde vist seg for å være HCV RNA positiv (mener HCV RNA konsentrasjon: 1,415,944 IU/ml, range: 2,479 - > 7,692,000 IU/ml), tilsvarende fullblod dele var tilgjengelig. Komparativ etterforskningen resulterte i en analytisk følsomheten til 100% for HCV RNA avgjørelser fra DBS eluates." 17
For å teste disponerte protokollen for utarbeidelse og behandling DBS under feltforhold, ble det brukt i nært samarbeid med Robert Koch-instituttet (Berlin, Tyskland) under pilot fase av studien "Narkotika og kronisk smittsomme sykdommer", som var utført på aktive narkotikabrukere i de tyske byene i Berlin og Essen18. Alle 534 deltakere registrert (433 menn og 101 kvinner) gjennomgikk kapillær blodprøve som beskrevet i detalj i delene 2.2.1-2.2.3 av foregående protokollen, og DBS var, igjen, elut med tillegg av 1000 µl PBS-baserte bufferen.
To personer ble diagnostisert å bli kronisk infisert med hepatitt b, og 39 viste serologisk mønster av en løst HBV-infeksjon. Videre femten deltakerne var positivt for anti-HBs (status etter vaksinasjon) og åtte ble funnet for å være positivt for anti-HBc alene. Anti-HCV-prevalensen blant deltakerne var 57.3% (N = 193) i Berlin og 73.0% (N = 144) i Essen. Fra antistoff-positive eksempler 65% (N = 125) og 62% (N = 89) ble også viremic. Tjuefem av 534 enkeltpersoner testet positivt for anti-HIV. Nitten av infeksjoner var allerede kjent og 24 av disse individene var co-smittet med HCV.
Resultatene av DBS testing ble nøye sammenlignet studie deltakernes anamnestic kort informasjon om statusen for egenrapporterte HBV og HCV. Denne sammenligningen sammen med resultatene av testingen kombinert serum/DBS par førte til mindre endringer av testing algoritmen for den viktigste fasen av "DRUCK studien", som vil melde aktive narkotikabrukere i seks flere store tyske byer: "personer infisert med HIV vil alltid bli testet for tilstedeværelsen av HBV DNA. Deltakere som DBS eluates er positive for anti-HBc eller anti-HBs bør utsettes for en venipuncture under en andre høring for å avklare definitivt anti-HBc/anti-HBs status og, til slutt alle DBS eluates vil bli vist for HCV RNA uavhengig av resultatene av anti-HCV testing." 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>Parametere</td>
			<td>Kombinert sera/DBS eluates (N)</td>
			<td>Discrepant resultater (N)</td>
			<td>Grunn for avvik mellom serum og DBS eluates</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>To pasienter med kronisk HBV-infeksjon. Begge var under antiviral behandling og en av dem var co-smittet med HIV. HBsAg konsentrasjonene i serum: 749 IU/ml og 6 IU/ml, henholdsvis.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>I serum hadde tjueto pasienter en løst HBV-infeksjon. Seks personer viste den serologisk finne "anti-HBc alene". Tjueto av pasientene var co-smittet med HIV. Fra "HBV resolvers", tjue ble vurdert som "Anti-HBs positiv alene" DBS tester og, dermed ble feilaktig klassifisert som "tilstand etter vaksinasjon".</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>Fire pasientene ikke co smittet med HIV hadde serum anti-HBs konsentrasjoner av 11 26 IU/l, som var for lavt til å tillate for påvisning av antistoff etter elueringsrør tørket blod flekker.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>De respektive sera hadde blitt Hentet fra sju pasienter med lav serum HBV DNA konsentrasjoner mellom 409 IU/ml 3,643 IU/ml.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HCV</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>Disse fire sera hadde blitt tatt fra pasienter med lenge siden løst HCV-infeksjoner.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV 1-p24/anti-HIV 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Resultatene fra 1,762 DBS, som ble utarbeidet og behandlet fra hele venøst blod etter protokollen foreslått i denne kommunikasjonen, sammenlignet resultatene i kombinert serumprøver som referanse.

Watch this Scientific Journal Video about Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques at JoVE.com

Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

Forberede og behandling av tørket blod flekker (DBS) for deres endelige analysen er fortsatt dårlig standardisert for de fleste diagnostiske programmer. For å overvinne dette brist, er en omfattende trinnvis protokoll foreslo og deretter evalueres med hensyn til effektiviteten for å oppdage markører for virusinfeksjoner.

Tørket blod flekker - forbereder og behandling for bruk i immunanalyser og i molekylær teknikker

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gjør-det-selv Enhet for gjenoppretting av Cryopreserved Prøver uhell falt inn Kryogeniske lagertanker

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Non-Terminal blodprøvetaking Teknikker i Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funksjonell tilberedning og Channel Aktivitet Målinger av Renset villtype og Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Gjentatte Blodprøvetaking for blodprøver Adult Sebrafisk

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Forsamlingen og anvendelse av &#39;Skjær Rings&#39;: A Novel endotel modell for Orbital, Enveis og Periodisk Fluid Flow og skjærspenning

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron skala Phenotyping teknikker av mais vaskulær pakker basert på X-ray Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...