Name: dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques
Uploaded: 2015-03-13T13:00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques at JoVE.com

Detta meddelande bygger på de resultat som tidigare publicerats i Virology Journal17 i öppen åtkomstläge enligt villkoren i Creative Commons Attribution License (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>) med BioMed Central som en licenstagaren. Författarna tacksamt erkänna det fruktbart samarbetet inom ramen för lotsning studien ”droger och kroniska infektionssjukdomar” (”DRUCK Study”) med U. Marcus, W. Cai, W. Zhang och R. Zimmermann från Robert Koch-Institutet (Berlin, Tyskland) och är tacksam till S. Moyrer för att ta fotografier monterade i figur 1 samt om D. F. Whybrew, Ph.D, (Göttingen, Tyskland) för att korrigera den manuskriptet. De uttrycker också sin uppskattning för skickliga tekniskt bistånd till J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. di, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, M. Schröter och K. Seidel. Denna studie stöddes delvis av ett bidrag på det tyska hälsoministeriet att den nationella referenscentrum för hepatit C.

Eftersom protokollet är utformat för användning i medicinsk diagnostik, måste dess tillämpning följa principerna i Helsingforsdeklarationen19. För den första delen av de resultat som presenteras i detta meddelande, både ett separat avtal av patienterna och godkännande av en etikkommitté tycktes vara umbärliga av två skäl: (1) ”vid upptagande” till Essen Universitetssjukhuset, ”varje patient ger skriftliga samtycke till att alla nödvändiga biokemiska, bakteriologiska och virologiska undersökningar ”. 17 (2) ”alla prover som används i hela utvärderingen av DBS testning skickades till virologiska håller på att rutinmässig klinisk diagnostik. Således ingen av exemplaren samlades specifikt i syfte att studien, inte en enda ytterligare venpunktion utfördes och inget av materialet testades för någon parameter än dem som krävs av läkare under normalt diagnostiska arbetet upp ”. 17 studien ”droger och kroniska infektionssjukdomar” (DRUCK studie ”)18, där DBS testning slutligen användes i de tyska städerna Berlin och Essen för att utvärdera sprutnarkomaner aktivt, godkändes av det Federal kommissionär för Data Skydd och frihet för Information (Berlin, Tyskland) samt av den etiska kommittén av medicinska universitet Charitéen, (Berlin, Tyskland).
1. insamling av blod
<ol><li>Venpunktion14, 15, 20, 21<ol>
<li>Sätta på engångs latex gummihandskar och rengör området för den avsedda punktionsstället (helst den median kubiska ven i antecubital fossa) med lämpligt desinfektionsmedel, t.ex., 70% isopropylalkohol.</li>
		<li>Applicera ett tryckförband 4 – 6 inches ovanför förmodad punktering platsen att distend venerna. Guida nålen i patientens ven och, när det är på plats, försiktigt fylla anslutna blodet röret, som innehåller EDTA som en antikoagulant.</li>
		<li>Så snart venpunktion är komplett, släpp tourniquet och dra ut injektionsnålen. Tryck sedan på en torr kompress på injektionsstället, som därefter kan hållas på plats av ett bandage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Huden punkteringen (figur 1A)13-15, 20, 22, 23<ol>
<li>Sätta på ett par engångs latex gummihandskar.</li>
		<li>Innan huden punktering, bör patienten värma sina händer. Fingret är masseras anterogradely den enrich blodet flyter mot punktera webbplats.</li>
		<li>Ren huden på palmar sidan av tip distala falangen av tredje eller fjärde fingret av icke-skrivande handen med lämpligt desinfektionsmedel, t.ex., 70% isopropylalkohol. Punktera huden genom en engångsbruk. säkerhet lancet. Finger bör hållas i en sådan position att tyngdkraften underlättar insamling av blod på fingertopparna.</li>
		<li>När samlingen kapillär blodflödet genom huden punktering är klar, placera ett bandage finger spets.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. beredning av blod fläckar
<ol><li>Förberedelse från blod som samlas in av venpunktion15<ol>
<li>Spot insamlade anti-koagulerat (EDTA) hela venöst blod på filtret korten så snart som möjligt. Inte förbereda torkat blod ställen mer än 24 tim efter venpunktion.</li>
		<li>Sätta alla uppgifter som behövs för identifiering av patienten på filterkortet. Ett kort bör upptäckas endast med blod av en enskild individ.</li>
		<li>Sätta på engångs latex gummihandskar.</li>
		<li>Vänd försiktigt bloduppsamlingsrör 2 – 4 gånger och därefter öppna proppen försiktigt.</li>
		<li>Aspirera 50 µl av hela venöst blod med hjälp av en pipett med en disponibel spets. Överföra blod till mitten av en cirkel utan att vidröra pappersfiltret direkt med spetsen på pipetten. Försök att helt mätta cirkeln.</li>
		<li>Upprepa proceduren för att fylla alla nödvändiga cirklar av kortet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förberedelse från blod som samlas in av hud punktera (siffror 1B och 1 C)13-16, 23<ol>
<li>Torka av den första droppen blod med en kompress eftersom den kan innehålla överflödig vävnadsvätska. Massera fingret igen för att öka blodflödet vid injektionsstället. Överför följande droppa till en av cirklar av en filterkort utan att vidröra ytan direkt med fingertoppen. Tillåt blodet att blötläggas i texturen av filtret genom kapillärkrafter endast.</li>
		<li>Låt nästa stora släpp av kapillära blod form på den finger-tip och samla det i nästa cirkel. Fortsätt proceduren tills alla nödvändiga cirklar är fyllda eller blodflödet slutar.</li>
		<li>Inte klämma eller ”mjölk” finger överdrivet om blodflödet inte är tillräckliga för att fylla alla nödvändiga cirklar av filtret kortet. Om blodflödet slutar placera ett bandage finger-spets. Utföra en andra hud punktering på ett annat finger om mer blod behövs för prövningen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. torka av blod fläckar
<ol><li>För att torka de blod-fläckarna, sätta filtret korten på ett rent papper handduk i ett biohazard säkerhet skåp och låt dem torka, helst O/N (men för minst 4 timmar), på RT i avsaknad av någon extern källa av värme. När torkningen är klar, de blod-fläckarna har ett enhetligt mörkt brunaktig färg och inga röda områden syns längre (figur 1 d)13, 15, 16.</li>
</ol>4. förvaring och transport av torkat blod fläckar (DBS)
Obs: Behandling av blod fläckar kan avbrytas efter torkning. Filter korten kan nu vara lagrade13-16, 23.
<ol><li>Förvaring, placera filterpapper kortet i en enda, gas-impermeable blixtlås påse, som innehåller 1 till 2 torkmedel påsar för att skydda preparaten från fukt (figur 1E). Du kan också lägga till ett luftfuktighet indikator kort.</li>
	<li>Överföra denna väska till en frys med en temperatur på-20 ° C eller lägre så snart som möjligt. Om frysar inte är tillgängliga under fältförhållanden, är lagring vid-4 ° C eller ens vid rumstemperatur genomförbart för upp till 14 dagar.</li>
	<li>Transportera frysta DBS prover på torris. För filter kort inledningsvis förvaras vid omgivande temperatur, använda en trippel förpackningssystem, som består av de dragkedja säcken/säckarna som den inre behållare samt ett inre och ett yttre kuvert. Utan innehåll markeringar krävs på ytterkuvertet för leverans med vanlig post men internationella biohazard symbolen skall anbringas på den primära inre behållare16.</li>
	<li>Exkludera filter korten vidare bearbetning om torkmedelsförpackningarna eller ytterligare fuktighet indikator kortet ändras till en rosa färg.</li>
</ol>5. eluering av torkat blod ställen13, 15, 16, 23
<ol><li>Stansa ut ett ställe med en engångsbruk 6 mm enhet från varje blodiga cirkel av Grade 903 filterkortet (figur 1F). Överföra alla stansade torkat blod fläckar från en enda patient till en brunn av 12-väl plattan.</li>
	<li>Fyll borrhålet med fosfatbuffrad saltlösning som innehåller 0,05% Tween-20 och 0,08% natriumazid (figur 1 g). Anpassa volymen tillsatt buffert till minimal respektive kraven i analysen används för efterföljande analys av torkat blod fläckar eluat.</li>
	<li>Upprepa dessa steg för att få en andra serie av torkat blod fläck eluat för att utföra molekylära analyser.</li>
	<li>Pålagt en laboratorium shaker cell kultur plattan och låt den stansade torkat blod fläckar försiktigt eluera i minst 4 timmar eller, helst, O/N (figur 1 H).</li>
	<li>Nästa dag, fläckarna är nästan fri från blod och Hemolytiskt supernatanterna har bildat (figur 1I). Överföra dessa eluat till mikrocentrifugrör. Sedan utsätta dem för centrifugering för 2 min vid 10 500 x g (figur 1J) gratis supernatanterna från eventuellt skräp som bildats under eluering (figur 1 K).</li>
</ol>6. analys av eluat
<ol><li>Centrifugeras eluat är nu redo att användas för de avsedda analyserna. Undersöka eluat för markörer för hepatit B, hepatit C-virus och HIV-infektion med kommersiellt tillgängliga kits och följ den respektive tillverkare instruktioner noggrant (figur 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> Figur 1. Grafisk Sammanfattning av protokollet föreslås i detta meddelande för beredning och bearbetning av torkat blod fläckar att användas i immunoanalyser och av molekylära tekniker. Hela venöst blod och kapillär erhålls genom venpunktion eller punktion av huden genom en lansett (A) kan tjäna som prover för torkat blod fläck analys. Efter överföring av blod till cirklar av en grad 903 filterkort (B, C), ska proverna torkas helst O/N vid omgivningstemperatur i biohazard säkerhetsdragskåp till formuläret platserna för en jämnt brunaktig färg utan någon interspersion röda områden (D). När du torkar av den blod-fläckar är komplett och lagring är nödvändig, filter korten kan förpackas i gas-impermeable blixtlåspåsar innehållande 1 – 2 torkmedel påsar (E). Ytterligare laboratorium bearbetning av DBS omfatta genereringen av slag från en 6 mm engångsbruk enhet från mitten av cirklarna (F, G), elueringen av slag i en PBS-baserad buffert i minst 4 timmar eller, helst, O/N på en shaker (H ), återvinning eluat (jag), och slutligen centrifugering av laboratoriet koppar (J) för att befria de DBS eluat från skräp som kan ha sitt ursprung under eluering processen (K). Därefter är de DBS eluat redo för analyser, som utfördes av en helt automatiserad plattform (L) för att upptäcka serologiska markörer för HBV, HCV och HIV infektioner, respektive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Tidigare fick RSR ett honorar för att leverera föreläsningar och finansiellt stöd för hans vetenskapliga arbete från Abbott diagnostik. NG och OM förklarar att de har inga motstridiga intressen.

DBS har använts i 100 år2 men förvånande nog finns det fortfarande ingen allmän konsensus om deras beredning och bearbetning. Hittills har en tillräcklig standardisering av denna viktiga före analytisk fas endast uppnåtts i fältet för nyfödda screening14, medan en mängd olika protokoll finns för alla andra program för DBS testning5, 16, 23. För att övervinna detta anmärkningsvärt heterogena, en omfattande steg för steg instruktion för att förbereda och bearbetning DBS för att utnyttjas i immunoanalyser och av molekylära tekniker presenteras i detta meddelande och utvärderas med avseende på dess effektivitet för att upptäcka markörer för HBV, HCV och HIV infektioner. Fokus i den följande diskussionen placeras främst på de olika stegen i föreslagna protokollet.
I historien av DBS testa många olika filterpapper kort har varit begagnade2 men idag bara två kommersiella källor är godkända av FDA som medicintekniska produkter i klass II för blood collection5, 16. Dessa filter kort system är mycket jämn och har mycket liknande absorptionsegenskaper så att analytiska resultat från capillary blod beredd på något av dem inte avviker med mer än 4 – 5%28. Inte överraskande, Masciotra och medarbetare29 därför upptäcktes HIV-1 RNA lika bra med en kvalitativ analys efter eluering från blod insamling kort från olika källor. Tanke på dessa uppgifter, kan det nästan utesluta att någon av de skillnader som observerats vid provning tillsammans serum/DBS par för markörer för HBV, HCV och HIV infektioner17 orsakades av valet av filterkortet ensam. Men när exakt kvantifiering av en analyt är oumbärlig, källa-till-source variant kanske inte längre är försumbar och mer sofistikerade tekniker, t.ex., perforerade DBS (PDB-filer) som en metod för microsampling30 eller beredning av torkade serum ställen kanske (DSS)31 som skall tillämpas i stället för konventionella DBS testar10.
Eftersom endast små mängder blod används för DBS testning (en droppe av kapillära blod består av cirka 50 µl)5, 16, variationer i provvolymen är avgörande och, visserligen på åtminstone några av skillnaderna mellan serologiska resultat och deltagarens självrapporterade HBV och HCV status som noterats under lotsning av ”DRUCK studien” är hänförliga till denna variabel. Den enskilt viktigaste faktorn för att minimera ”fluktuationer” av provvolymen är utan tvekan en rätt teknik av kapillära blodinsamling, som endast kan uppnås genom noggrann och pågående utbildning av teknisk personal22. Dessutom som ett mått på kvalitetskontroll, bör alla laboratorier som arbetar med DBS har redan inlett förfaranden för att identifiera och därefter exklusive DBS exemplar som måste anses som ogiltig eller otillfredsställande16.
Studierna bedrivs främst i samband med HIV32 och nyfödda screening33 har visat att hög luftfuktighet kan leda till en försämring av analyter, men hittills ingen enighet har nåtts när det gäller frågan om hur länge DBS bör vara lufttorkad . Ett intervall på minst 4 tim eller helst O/N föreslås i detta meddelande, som antog därför villkor som användes i den stora majoriteten av alla relevanta publikationer32, 34 Data lagring av DBS som därefter används för HBV och HCV tester är motstridiga. I 1981, Villa och medarbetare35, som tillämpas moderna analystekniker, rapporterade att lagring på RT inte påverkade resultaten av HBV analyser under hela observationsperioden på 180 dagar om antikroppsnivåerna var var > 1/1 000, men att DBS blev borderline-positiv eller rentav negativ efter 15 dagar när titrar i serum var endast 1/100. Lagring vid-20 ° C eller 4 ° C resulterade inte i en väsentlig förbättring. Däremot en studie utförd trettio år senare36 testas replikerar provvikt HBV-positiva, och författarna fann att anti-HBc samt anti-HBs antikroppar var stabil upp till 183 dagar på RT, medan HBsAg på samma villkor blev falskt negativa redan efter 63 dagar. När det gäller identifiering av HBV-DNA från DBS eluat, koncentrationen av den viral nukleinsyra var stabil under minst sju dagar vid 37 ° C37 eller visat sig vara ”resistent” till lagring på RT i upp till tre veckor38. Test för anti-HCV-antikroppar med två kommersiellt tillgängliga tredje generationens immunanalyser39 föreskrivs under 117 dagar använder DBS prover lagras vid-20 ° C, 2 – 8 ° C och 20 – 25 ° C, respektive korrekta resultat. Lagring vid-20 ° C, resulterade dock i lägsta variationen av optiska densiteter. Tillämpa en fjärde generationens anti-HCV-ELISA, dvs Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, i samband med DBS testning, Larrat o.a. 40 observerat en kraftig minskning av analytisk specificitet efter förvaring DBS exemplaren i mer än tre dagar på RT. Däremot, erhölls exakt test resultat med samma kit utnyttja prover deponeras i 60 dagar under olika förhållanden (-20 ° C, 2 – 8 ° C och 22 – 26 ° C) av Brandao och medarbetare41. Observationer på nedgång av HCV-RNA koncentrationer i DBS under olika lagringsförhållanden alltifrån ingen betydande förändring på RT för upp till ett år42 till en tiofaldig förändring efter fyra veckor vid omgivningstemperatur43. Med denna ganska motstridiga uppgifter på stabiliteten av HBV och HCV antigener, nukleinsyror och antikroppar hänsyn, verkade det rimligt att dra tillbaka i föreslagna protokollet till ett samförstånd, som definierades tidigare för lagring av DBS exemplar som ska användas för HIV-testning15, 30: för kortsiktiga nedfall (upp till två veckor) antigener, viral nukleinsyra och antikroppar betraktas som stabil på RT, optimal lagring under längre perioder är frysta villkor.
Som regel tre parametrar bör övervägas när du utformar ett eluering protokoll: (1) eluering bufferten; (2) varaktighet och temperatur på eluering; och (3) den eluering volym23. I majoriteten av alla relevanta publikationer fosfatbuffrad saltlösning (PBS) användes för eluering DBS, och de flesta författarna lagt ett protein, t.ex., bovint serum albumin (BSA) eller Tween 20, ett ytaktivt ämne, för att förbättra analysen signalen genom att stabilisera proteiner, eftersom de går i lösning och samtidigt blockera icke-specifik bindning webbplatser23. Finns endast några rapporter, som direkt jämför olika eluering buffertar i samband med DBS testning. Villar o.a. 36, t.ex., registreras nästan motsvarande eluering kapacitet för alla buffertar används, men PBS/BSA 0,5% resulterade i den lägsta nivån av icke-specifika reaktivitet. En mycket liknande observation gjordes av Croom och medarbetare44 vid applicering i provspädningsmedel av den genetik system rLAV MKB för elueringen av anti-HCV-antikroppar från DBS. Eftersom risken för provet nedbrytning är ytterst låg under de första timmarna efter beredning av DBS (se ovan), beslutades det att ruva fläckarna O/N vid rumstemperatur och att stödja eluering av mild över slut blandning. Denna metod har fördelen att exemplaren stansas ut föregående dag kan direkt överföras till rutinmässiga diagnostiken tidigt nästa morgon23. Volymen av eluering bufferten bör anpassas till de minimala respektive kraven av de analyser som används för efterföljande analyser för att hålla utspädningsfaktorn så låg som möjligt. En noggrann optimering av eluering villkor för varje enskild analyt var dock inte möjligt i den föregående utvärderingen eftersom en hög provkapacitet hade ska garanteras i en relativt kort tid under den ”DRUCK studie”17. Följaktligen användes ganska ofördelaktiga volymen av 1000 µl av PBS-baserad buffert för att slutföra hela eluering processen för alla parametrar i två separata verksamheter.
Detta synsätt en å ena sidan misslyckas ”helt i anti-HBc/anti-HBs systemet för de individer infekterade med HIV på grund av de låga antikropp koncentrationerna; ... och det krävs molekylär biologiska förfaranden med optimal Analytisk känslighet när det gäller HBV DNA och HCV RNA tester ”. 17 däremot, hög elutionsvolymen visade sig vara på något sätt ofördelaktig för bestämning av HBsAg, anti-HCV- och anti-hiv av Kit används i hela utvärderingen. ”Upptäckten av HBsAg positiva material från helblod eluat lyckades med en känslighet på 98,6% i lika hög grad som i tidigare studier, som delvis hade använt en mycket mindre elutionsvolymen 100 µl, 250 µl, eller 600 µl eller 500 µl”17 ,36, 45, 46. Känsligheten hos 97,8% fastställts i utredningen av 179 serum/DBS par för anti-HCV-antikroppar motsvarade resultaten av redan befintliga rapporter24, 44, 47, 48, 49, som hade arbetat med en elutionsvolymen som var lägre med en faktor på 5 till 10. ”Dessutom protokollen för anti-HCV-upptäckt hade varit korrekt optimerad... genom att föreskriva egna brytpunkterna”17, 24, 48, 49 ”eller genom att öka de prov volymerna från 20 µl till 100 µl”. 17, 49 slutligen den analytisk specificitet och känslighet (100% vardera) fastställts för anti-hiv upptäckt var lika eller bättre än prestandaegenskaper för andra immunanalyser specifikt anpassat till DBS testning50, 51 ”eller en stegvis förfarandet med kombinerad användning av flera anti-HIV tester ”17,52. ”De, faktiskt, även överskridit prestanda rekordet av en analysmetod som hade varit speciellt utvecklad och optimerad för detektion av anti-HIV-antikroppar i DBS eluat (Q-förhindra HIV 1 + 2 DBS kit)”. 17, 53  
Sammantaget den omfattande stegvisa protokoll som presenteras i detta meddelande visade sig vara ett genomförbart och användarvänligt verktyg för att förbereda och bearbetning DBS och kan således användas på ett tillförlitligt sätt i diagnostiska virologi. Det tillåter metoder använder automation 54 och på grund av dess utmärkta prestanda har potential att fungera som en slags fundament-stena för ett framtida allmänt accepterad konsensus protokoll i fältet global DBS tester i laboratorium medicin.

Idén att använda blod som samlas in på ett papperskort tillverkade av cellulosa tillskrivs Ivar Christian Bang (1869 – 1918), far till moderna kliniska mikroanalys1, 2. 1913, Bang beslutsamma glukos från eluat av torkat blod fläckar (DBS)3 och senare uppträdde även kväve mätningar med Kjeldahl-metoden med denna filterpapper teknik2. Därefter flera utredare rapporterade om användning av DBS för serologiska tester för att diagnostisera syfilis2. Så tidigt som i 1924, Chapman sammanfattas fördelarna med DBS testning när han särskilt betonade fyra poster, som gäller fortfarande idag: (1) jämfört med konventionella venpunktion, mindre blodvolym krävs och detta faktum var viktigast i pediatrisk diagnostik; (2) blod insamling är enkel, icke invasiv, och billig; (3) risken för bakteriell kontamination eller hemolys är minimal. och (4) DBS kan bevaras under långa perioder med nästan ingen försämring av analyter2, 4. Förutom dess användning i test för syfilis, ingår ytterligare tidiga tillämpningar av DBS tekniken, t.ex., påvisande av antikroppar mot mässling, påssjuka, poliovirus, parainfluensa virus och respiratory syncytial virus (RSV) i 19532, identifiering av Shigella i avföring intorkat på filterpapper och levereras med vanlig post från Indonesien till Leiden i Nederländerna samt detektion av antikroppar mot Schistosoma i DBS i endemiska områden och analyseras mer än tre månader senare5 . I 1963 publicerat femtio år efter Bangs ursprungliga meddelande2, 6, Guthrie slutligen sin berömda metod för diagnos av fenylketonuri från DBS erhålls genom en häl prick från nyfödda7, 8.
Även om från den tiden och framåt, DBS betraktades som en allmänt tillämplig metod för att samla in, lagra, transportera och analysera en mängd människors kroppsvätskor5, deras användning i diagnostik var fortfarande huvudsakligen inriktad på diagnos av infektioner särskilt i begränsade resurser inställningar och systematisk screening av nyfödda för ärftliga metabola sjukdomar för årtionden9, 10. Sedan 2005 har dock en mängd nya och innovativa DBS tillämpningar har börjat växa fram. Detta resulterade i en nästan exponentiell ökning i antalet respektive vetenskapliga publikationer på DBS från ca 50 till nästan 450 årligen i dagsläget. Bland de framväxande program är olika områden såsom toxikologisk - och farmakokinetiska studier, metabolisk profilering, terapeutisk övervakning, rättskemi eller miljöförorening kontroll10, 11.
DBS testning har således gjort ett segertåg genom kliniska Laboratoriumdiagnostik under senaste 100 år2. Liksom i klinisk kemi12, dock ansågs under mars före analytiska variabler inte tillräckligt i många år. Ja, även idag, efter sådan framstående verksamhet som CDC: s filterpapper utvärdering projektet13 eller utformningen av en nationell standard för blodinsamling på filterpapper inom ramen av nyfödda screening14, fasen före analytisk är fortfarande i stort sett undervärderade i de flesta av de andra fälten, där DBS testning är tillämpad5, 10.
Mot den bakgrunden föreslås en omfattande stegvisa protokoll14-16 för användning i immunoanalyser och i molekylära tekniker, som omfattar alla väsentliga steg, för att förbereda och bearbetning DBS i följande meddelande: (1) insamling av blod; (2) förberedelse av blod fläckar; (3) torkning av blod fläckar; (4) lagring och transport. (5) eluering av DBS; och slutligen (6) analyser av DBS eluat. Effektiviteten av protokollet utvärderades först med 1 762 kopplat serum/DBS par för påvisande av hepatit B virus (HBV) ytantigen (HBsAg), antikroppar mot HBV core-antigen (anti-HBc), antikroppar mot HBV ytantigen (anti-HBs), HBV-DNA, antikroppar hepatit C-virus (HCV) (anti-HCV), HCV-RNA och humant immunbristvirus (HIV) 1-p24-antigen/anti-HIV 1/2 med antingen en helt automatiserad plattform eller känsliga kvalitativa nukleinsyra provningar. 17. i ett andra steg, protokollet utnyttjades i den pilotstudie ”droger och kroniska infektionssjukdomar” (”DRUCK Study”) som genomfördes av Robert Koch-Institutet i nära samarbete med de nationella referenscentrum för hepatit C på aktiv narkotikamissbrukare i de tyska städerna Berlin och Essen18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Latex rubber gloves</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#4049500041515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td>#9768050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulifly safety cannula</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#85.1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA blood collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#02.1066.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#2994163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry gauze pad</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#143213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singel-use safety lancet</td>
			<td>Owen Mumford</td>
			<td>#3802421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Card</td>
			<td>Whatman/sigmaaldrich</td>
			<td>#10534612</td>
			<td>Filter paper card Grade 903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>#S1126-7810, #S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper bag</td>
			<td>Flexico</td>
			<td>#20219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini desiccant bag</td>
			<td>Tropack</td>
			<td>#-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Punch</td>
			<td>pfmmedical</td>
			<td>#48601</td>
			<td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Forceps</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>#H7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A1389.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#66880250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HBsAg (Qunatitative)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBc II</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#8L4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBs</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#7C1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HCV</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#4J2727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#6374891001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artus HBV LC PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td>#2554311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

Idén att samla in blod på ett papperskort och därefter använda den torkat blod fläckar (DBS) för diagnostiska ändamål påbörjade ett sekel sedan. Sedan dess har DBS testning för årtionden har förblivit huvudsakligen inriktad på diagnos av infektionssjukdomar särskilt i begränsade resurser inställningar eller systematisk screening av nyfödda för ärftliga metabola sjukdomar och bara nyligen har en mängd nya och innovativa DBS program börjat växa fram. Under många år ansågs bara olämpligt före analytiska variabler i fältet av DBS testning och även idag, med undantag för nyfödda screening, den hela pre analytisk fas, som består av beredning och bearbetning av DBS för deras slutliga analysen har inte standardiserats. Mot den bakgrunden föreslås ett omfattande stegvisa protokoll, som omfattar al de grundläggande faserna, dvs insamling av blod; beredning av blod fläckar; torkning av blod fläckar; lagring och transport av DBS; eluering av DBS, och slutligen analyser av DBS eluat. Effektiviteten av detta protokoll utvärderades först med 1 762 kopplat serum/DBS par för att upptäcka markörer för hepatit B, hepatit C virus, och humant immunbrist virusinfektioner på en automatiserad analytisk plattform. I ett andra steg var protokollet utnyttjas under en pilot studie, som genomfördes på aktiva narkotikamissbrukare i de tyska städerna Berlin och Essen.

Effektiviteten i protokollet föreslås för beredning och bearbetning av DBS utvärderades först genom att analysera 1 762 kopplat serum/DBS par för markörer för HBV, HCV och HIV-infektion. 17. för detta ändamål, DBS utarbetades från 100 µl hela venöst blod (jfr punkterna 2.1.1 – 2.1.6 av föregående protokoll) och var elueras med 1000 µl av PBS-baserade buffert, varje, (jfr punkterna 5.1-5.5 i nämnda protokollet) för att slutföra processen för alla sju parametrar i två separata verksamheter. Ett sådant tillvägagångssätt utan noggrann optimering av eluering villkor för varje enskild analyt tycktes vara oundvikliga eftersom en ganska hög provkapacitet förväntades i en relativt kort tid under kommande fältstudien ”droger och kronisk Smittsamma sjukdomar ”(” DRUCK studie ”).
Alla mätningar följs tillverkarens rekommendationer i samband med DBS analyser men hade ändras med avseende på HBsAg och anti-HBs bestämningar för att kompensera för effekten av hemolys eller resultatet av utspädning. Med ett cut-off värde på 0,05 IE/ml, HBsAg testning av DBS eluat leder till en hastighet av falsk-positiv 14,7% (52 av 354) jämfört till serum prover (figur 2A). Mottagare verksamma karakteristiska (ROC) analys25, 26 av data anges att en ökning av tröskeln till 0,15 IU/ml skulle resultera i en perfekt separation av HBsAg-positiva från HBsAg-negativ (0.986 [känslighet], 0.000 [1-specificitet], (Se figur 2B). Däremot, med en cut-off 10 IU/l för kvantifiering av anti-HBs inspelade antikroppar ett falskt negativa mätningar av 14,2% (47 av 331) var (figur 2 c). Därför efter ROC analys igen, denna cut-off sänktes till 1,5 IE/l att uppnå en optimal diskriminering av värden (0.917 [känslighet], 0,007 [1-specificitet], figur 2D).
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> Figur 2. HBsAg och anti-HBs testning i DBS eluat (modifierad från17). ROC-guidad ökningen av cut-off värdet för HBsAg kvantifiering från 0,05 IU/ml a till 0,15 IE/ml minskade (B) frekvensen falskt positiva resultat från 14,7% till 0%. Likaså föreslog ROC analys av anti-HBs koncentrationer en minskning av respektive tröskeln från 10 IU/l (C) till 1,5 IU/l (D), därmed helt eliminera falsk-negativ, som ursprungligen stod för 14,2% av alla bestämningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
Resultaten av analyserna som kopplat serum/DBS sammanfattas i tabell 117. Inga icke-selektivitet spelades under DBS testning för någon av de sju analyterna.
När DBS eluat undersöktes förekomsten av HBsAg, i. e. den serologiska nyckelparameter både akut och kronisk infektion med HBV fastställdes en analytisk känslighet på 98,6%. HBsAg koncentrationer i två falskt-negativa sera var 749 IU/ml och 6 IU/ml, respektive. Anti-HBc-antikroppar upptäcktes framgångsrikt i 176 av 204 (i. e 86,3%) DBS eluat. Tjugotvå av 28 exemplaren som inte upptäcktes av de mätningar som härstammar från individer som samtidigt är infekterade med HIV. Således, om HIV-positiva individer uteslöts från beräkningen, en känslighet på 97,1% uppnåddes för att hämta anti-HBc antikroppar från eluerade torkade hela venöst blod. Liknande observationer hållas sant för bestämning av anti-HBs antikroppar. Även efter justering av cut-off värdet av analysen till 1,5 IU/l inträffade nio avvikande serum DBS resultat. Hos de patienter som inte samtidig infektion med HIV, fanns anti-HBs serumkoncentrationerna av 11 – 26 IU/l, som var för låg för att möjliggöra detektion efter eluering av torkat blod.
Anti-HCV-antikroppar är ett tecken på en infektion som antingen akut eller kronisk eller löst. Endast fyra (i. e. 2,2%) falskt-negativa anti-HCV-resultat bestämdes från DBS eluat och ytterligare serologiska och molekylära analyser visade tydligt att de respektiva sera togs mycket troligen från patienter, vars infektioner hade sedan länge varit löst.
Detektion av anti-HIV-antikroppar i DBS vineluat med helautomatiska system var en helt slät process som gett en analytisk känslighet på 100%.
”Genomsnittlig HBV-DNA-koncentration från helblod eluat utfördes på 100 exemplar (menar DNA-koncentration: 1,573,898 IE/ml, range: < 357 - > 17,860,000 IE/ml) och gav ett värde på 93,0%. Sju prover med låga serumkoncentrationer av HBV-DNA mellan 409 och 3 643 IU/ml upptäcktes således inte av DBS testning. Av 100 sera som hade visat sig vara positiva för HCV-RNA (menar HCV RNA-koncentrationen: 1,415,944 IE/ml, range: 2 479 - > 7,692,000 IE/ml), motsvarande helblod alikvoter fanns tillgängliga. Den jämförande undersökningen resulterade i en analytisk känslighet på 100% för HCV RNA bestämningar från DBS eluat ”. 17
För att testa disponerade protokollet för förberedelse och bearbetning DBS under fältförhållanden, användes det i nära samarbete med Robert Koch-Institutet (Berlin, Tyskland) under pilotfasen av studien ”droger och kroniska infektionssjukdomar”, som var bedrivs på aktiva narkotikamissbrukare i de tyska städerna Berlin och Essen18. Alla 534 deltagare inskrivna (433 män och 101 kvinnor) genomgick kapillär blodprovstagning som beskrivs i detalj i avsnitt 2.2.1 – 2.2.3 i föregående protokoll, och DBS var, återigen, eluerat genom tillsats av 1000 µl av PBS-baserad buffert.
Två personer diagnostiserades för att vara kroniskt infekterade med HBV och 39 visade serologiska mönstret av en löst HBV-infektion. Dessutom femton deltagare var positiva för anti-HBs (status efter vaccinationen) och åtta befanns vara positivt för anti-HBc ensam. Anti-HCV-prevalensen bland deltagarna var 57,3% (N = 193) i Berlin och 73,0% (N = 144) i Essen. Från antikroppspositiva prover 65% (N = 125) och 62% (N = 89) var också viremic. Tjugofem av de 534 personerna testade positivt för anti-HIV. Nitton av infektioner var redan kända och 24 av dessa individer var Co-infekterade med HCV.
De resultat som erhålls genom provning av DBS jämfördes noggrant med studien deltagarnas anamnestiska data angående självrapporterad HBV och HCV status. Denna jämförelse tillsammans med resultaten av tester tillsammans serum/DBS par ledde till smärre ändringar av testning algoritmen för den viktigaste fasen av ”DRUCK studien”, som kommer att registrera aktiva narkotikamissbrukare i sex ytterligare stora tyska städer: ”individer infekterade med HIV ska alltid testas för förekomst av HBV-DNA. Deltagare vars DBS eluat är positiva för anti-HBc eller anti-HBs bör underkastas en venpunktion under ett andra samråd för att definitivt klargöra deras anti-HBc/anti-HBs-status och, slutligen, alla DBS eluat kommer att undersökas för HCV-RNA oavsett resultatet av anti-HCV test ”. 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>Parametrar</td>
			<td>Kopplat sera/DBS eluat (N)</td>
			<td>Avvikande resultat (N)</td>
			<td>Anledning till avvikelser mellan testning serum och DBS eluat</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>Två patienter med kronisk HBV-infektion. Båda var under antiviral behandling och en av dem var Co-infekterade med HIV. HBsAg-koncentrationer i serum: 749 IU/ml och 6 IU/ml, respektive.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>I serum hade tjugo patienter en löst HBV-infektion. Sex personer visade den serologiska fynd ”anti-HBc ensam”. Tjugotvå av patienterna var Co-infekterade med HIV. Från de ”HBV matcharna”, tjugo bedömdes som ”anti-HBs positiva ensam” av DBS testning och, således, falskeligen klassificerades som ”skick efter vaccination”.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>De fyra patienterna inte samtidig infektion med HIV hade anti-HBs serumkoncentrationerna av 11 ‑ 26 IU/l, som var för låg för att tillåta för påvisande av antikroppar efter eluering av torkat blod fläckar.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV-DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>Respektive sera hade erhållits från sju patienter med HBV-DNA av låga serumkoncentrationer, som alltifrån 409 IU/ml till 3 643 IU/ml.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-HCV-</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>Dessa fyra sera hade tagits från patienter, med långa sedan löst HCV-infektioner.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV-RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV 1-p24/anti-HIV 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Resultat från 1 762 DBS, som var förberedd och bearbetas från hela venöst blod efter protokollet föreslås i detta meddelande, jämfört med resultaten i kopplat serumprov som referens.

Watch this Scientific Journal Video about Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques at JoVE.com

Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

Att förbereda och bearbetning av torkat blod fläckar (DBS) för deras slutliga analys är fortfarande dåligt standardiserade för de flesta diagnostiska program. För att övervinna denna brist, är ett omfattande stegvisa protokoll föreslog och därefter utvärderas med avseende på dess effektivitet för att upptäcka markörer för virusinfektioner.

Torkat blod fläckar - förberedelse och bearbetning för användning i immunoanalyser och molekylärbiologiska metoder

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mikroinjektion Tekniker för att studera Mitos i Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Den mikroflödessystem Probe: Drift och användning för lokaliserad ytbehandling

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gör-det-själv Device för återhämtning av kryokonserverade prover Tappade misstag i Kryogena Lagringstankar

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Icke Terminal Blood Provtagningstekniker i marsvin

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionell beredning och Kanalaktivitets Mätningar av renat Vildtyps och Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Upprepad Blood Collection för Blodprov i vuxen Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Församlingen och tillämpning av &quot;Shear ringen&quot;: A Novel Endothelial modell för Orbital, enkelriktad och periodisk vätskeflöde och Shear stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-skala fenotypning tekniker för majs kärlknippena baserat på röntgen Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...