Name: protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. Desarrollo de embriones cigóticos <ol><li> Material Vegetal <ol><li> Crece la Medicago truncatula tipo salvaje Jemalong o su isogénica más cercana, altamente re-generable genotipo Jemalong 2HA 13 (conocido como 2HA) en un invernadero con un fotoperíodo de 14 horas y 23 ° C / 19 ° C de temperatura día / noche. <ol><li> Pierce la superficie de la cubierta de la semilla (con una aguja de 23 G) antes de sembrar la semilla de modo se permite que el agua para entrar en la semilla y en remojo en...

<ol>
	<li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference.">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li><li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes:+importance+and+constraints+to+greater+use.">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li><li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes.">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li><li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation.">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li><li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling.">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li><li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo.">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li><li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs.">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li><li>Birnbaum, K. D., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+across+kingdoms:+regeneration+in+plants+and+animals.">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li><li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis.">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li><li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues.">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li><li>Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+seeds+and+embryos+of+Medicago+truncatula+cultured+in+vitro.">Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro.</a> Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).</li><li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

Los protocolos descritos son relativamente sencillo y permiten la investigación de la embriogénesis leguminosa con toda la célula contemporánea y técnicas moleculares. Reconocemos que hay ventajas y desventajas de ambos in vivo e in vitro enfoques. Ambos permiten un mayor enfoque en la embriogénesis temprana en comparación con la cultura de las semillas inmaduras 19. En el caso de los estudios in vivo lo que se describe es predominantemen...

Las legumbres son la tercera familia más grande de plantas superiores, con aproximadamente 20.000 especies y el (o Fabaceae) familia de las leguminosas son segundos a los cereales en la superficie cosechada y la producción total 1. La soja es el cultivo cultivado tercera más grande. Leguminosas de grano proporcionan alrededor de un tercio de la proteína dietética y un tercio de aceite vegetal para el consumo humano 2. Legumbres con su capacidad de fijación de N2 también contribuyen a los sistemas agrícolas sostenibles. Medicago truncatula, como la soja, las tiendas de proteína y aceite en los cotiledones de las semillas y es una leguminosa modelo genética y genómica con considerables recursos genéticos y genómicos 3,4. Mientras M. truncatula ha permitido avances en la comprensión de la leguminosa simbiosis Rhizobium 4 se ha empleado cada vez más para estudiar la biología de semillas de leguminosas 5-7 y embriogénesis 8,9. Embriogénesis Arabidopsis ha sido ampliamente estudiado 10,11 pero isa no leguminosas y los detalles de la embriogénesis no son idénticos a Medicago 8,10. Embriogénesis cigóticos en M. truncatula tiene características interesantes, con un hipófisis multicelular distintivo, un suspensor endoployploid y transferencia de células basales 8. La embriogénesis somática (SE) se utiliza comúnmente para la regeneración de plantas 12. En el modelo de leguminosas M. truncatula, la línea de semillas Jemalong 2HA (2HA) se ha desarrollado a partir de la matriz Jemalong tener altas tasas de embriogénesis somática 13. El número de embriones producidos recientemente se ha incrementado sustancialmente por la adición tanto de ácido giberélico (GA) y ácido abscísico (ABA) al medio de largo establecido 14. En este caso, GA y actuar sinérgicamente ABA, que es inusual dado que GA y ABA generalmente actúan antagónicamente 14. Los embriones producidos a partir de callos se desarrollan en la superficie que permite la etapa de la embriogénesis a ser determinada fácilmente Visually cosechado y fácilmente. Tener cerca de líneas isogénicas que son embriogénico (2HA) y no embriogénico (Jemalong) facilita la investigación de la embriogénesis somática y que tiene tanto in vivo como sistemas in vitro proporciona diferentes posibilidades experimentales. La comprensión de los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo embrionario es esencial para la comprensión de semillas y desarrollo de la planta. En las legumbres, como en otras dicotiledóneas, son los cotiledones del embrión que almacenan los productos que se utilizan para la nutrición humana. Embriogénesis temprana implica la división de células, y los patrones de embriones correcta. En aproximadamente 8 días después de la fecundación, el M. truncatula embrión alcanza etapas tempranas de cotiledones. La caracterización morfológica no se indica exactamente por día después de la fecundación en condiciones de invernadero. Por lo tanto, un enfoque estandarizado eficiente para indicar la etapa de embriones en desarrollo es valioso en el estudio de la genética Regulación de principios de la embriogénesis cigóticos. En este trabajo, ofrecemos dos protocolos estandarizados para recoger embriones en desarrollo para estudios biológicos de la embriogénesis en el modelo de leguminosas M. truncatula. El primero es recoger embriones cigóticos asociando la embriogénesis y pod morfología mientras que la segunda es la embriogénesis somática a través de explantes de hoja de cultivo para proporcionar los números de embriones grandes de fácil acceso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >P4 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Major salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minor salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vitamins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Bacto agar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plant hormones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Abscisic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Benzylaminopurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3274</td>
			<td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gibberellic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7645</td>
			<td>Dissolve in small amount of ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZFLIII</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiophot</td>
			<td>Or similar, with suitable optics</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam HRc</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilising leaves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>75.9922.519</td>
			<td>Autoclavable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

La embriogénesis temprana a partir de una sola célula cigoto pasa a través de una rápida división celular y la morfogénesis, y se caracteriza morfológicamente por etapas pre-globular, globulares, corazón, de torpedos y de cotiledones. Este desarrollo progresivo está bajo la regulación estricta de una red molecular compleja. La recolección de suficientes embriones tempranos en una etapa similar de desarrollo es esencial para la investigación de la regulación celular y molecular de la embriogénesis temprana. Esto no es directo desde la embriogénesis temprana sufre morfogénesis rápido en un corto periodo de tiempo, por ejemplo 8 días para Medicago truncatula para llegar al estadio de cotiledones temprano. Aquí, abordamos el tema por dos enfoques. El primero establece una vinculación entre el desarrollo del embrión y la morfología pod en ayudar a indicar la etapa del embrión cigóticos. Esto se basa sobre todo en el número de espirales de la vaina y el desarrollo de las espinas. Una forma alternativa para complementar la in vivo sos estudios es a través de explantes de hoja de cultivo para producir embriones somáticos. El medio incluye una combinación de hormonas inusual - una auxina (ácido 1-naftalenacético), una citocinina (6-bencilaminopurina), el ácido abscísico y ácido giberélico. Las diferentes etapas se pueden discernir que crece fuera del callo sin disección.

Para embriogénesis diferentes estructuras vaina cigóticos correspondientes a las diferentes etapas de embriones se muestra en la Figura 1A - F, mientras que las diferentes etapas de embriones se muestran en la Figura 2A - F. Mediante la selección de las vainas en la misma etapa, las muestras de óvulos que son bastante uniforme puede obtenerse (Figura 3A). Mediante el uso de RT-qPCR embrión genes específicos se pueden detectar fác...

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de ARN dentro del embrión temprano de Drosophila

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Un sistema optimizado de O9-1/hidrogel para estudiar señales mecánicas en células de cresta neural

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido adiposo de rata para la diferenciación en células productoras de insulina

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

En Face Preparación del cojín endocárdico para el análisis de morfogénesis plana en embriones de ratón

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...