Name: epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. part iii. virus detection by rt-qpcr
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR at JoVE.com

The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

<ol>
	<li>Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+in+nondisinfected+drinking+water+from+municipal+wells+and+community+incidence+of+acute+gastrointestinal+illness.">Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness.</a> Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).</li><li>Ye, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+detection+of+enteric+viruses+in+source+water+and+treated+drinking+water+in+Wuhan,+China.">Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China.</a> Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).</li><li>Williamson, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+viruses+in+New+Zealand+drinking-water+sources.">Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources.</a> Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).</li><li>Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+viral+acute+gastrointestinal+illness+from+nondisinfected+drinking+water+distribution+systems.">Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).</li><li>Chigor, V. N., Okoh, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus,+rotaviruses+and+enteroviruses+in+the+Buffalo+River+and+source+water+dams+in+the+Eastern+Cape+Province+of+South+Africa.">Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).</li><li>Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+reverse+transcription-PCR+method+for+detection+of+human+enteric+viruses+in+groundwater.">A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).</li><li>Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroenteritis+outbreak+caused+by+waterborne+norovirus+at+a+New+Zealand+ski+resort.">Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).</li><li>Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+contamination+of+a+drinking+water+supply+at+a+hotel+resort.">Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort.</a> New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).</li><li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming,+2001.">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li><li>Parshionikar, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waterborne+outbreak+of+gastroenteritis+associated+with+a+norovirus.">Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).</li><li>U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria. , 1-63 (2012).</li><li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+measured+indicators+of+recreational+water+quality+and+swimming-associated+illness+at+marine+beaches:+a+prospective+cohort+study.">Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study.</a> Environ. Health. 9, 66 (2010).</li><li>Fout, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , 1-91 (2012).</li><li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water.">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li><li>Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+mitigating+inhibition+during+quantitative+real+time+PCR+analysis+of+viral+nucleic+acid+extracts+from+large-volume+environmental+water+samples.">Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples.</a> Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).</li><li>Fuentes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+multiplex+one-step+qRT-PCR+for+hepatitis+A+virus,+norovirus+GI+and+GII+quantification+in+bivalve+mollusks+and+water.">Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water.</a> Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).</li><li>Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+extraction+methods+for+the+detection+of+hepatitis+A+virus+in+lettuces+using+the+murine+norovirus+as+a+process+control.">Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control.</a> J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).</li><li>Sen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , 1-56 (2004).</li><li>Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription-PCR+detection+of+hepatitis+G+virus.">Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus.</a> J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).</li><li>De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+enteroviruses+and+hepatitis+A+virus+in+environmental+samples+by+gene+probes+and+polymerase+chain+reaction.">Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction.</a> Proc. Water Qual. Technol. Conf. , 833-853 (1990).</li><li>Monpoeho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+enterovirus+RNA+in+sludge+samples+using+single+tube+real-time+RT-PCR.">Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR.</a> BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).</li><li>Jothikumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+noroviruses+by+using+TaqMan-based+one-step+reverse+transcription-PCR+assays+and+application+to+naturally+contaminated+shellfish+samples.">Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).</li><li>da Silva, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment,+using+real-time+reverse+transcription-PCR:+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II.">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li><li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus.">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li><li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish.">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li><li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure.">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li><li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay,+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR.">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li><li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples.">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li><li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR.">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li><li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria,+MS2+and+murine+norovirus.">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , (1996).</li><li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR.">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li><li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+of+enteroviruses,+adenoviruses,+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters.">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li><li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters.">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li><li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples.">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li><li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water,+using+Salmonella+as+a+model+organism.">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water.">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li><li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt,+humic+acid,+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters.">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses,+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater.">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Крупномасштабные национальные исследования вирусного заражения источника и питьевых вод требует использования нескольких аналитических лабораторий. В этих условиях стандартный метод необходим, чтобы гарантировать, что данные порождается нескольких лабораторий сравнима. Есть много опубликованных молекулярные методы для обнаружения вируса, но очень мало стандартизированные методы молекулярной. EPA Метод 1615 представляет собой стандартизированный метод специально разработан для обнаружения энтеровирусов и норовируса в водных матрицах по RT-КПЦР. Стандартные методы молекулярной доступны для обнаружения вирусов в пищевых продуктах (CEN / TS 15216-1 ISO и CEN / TS 15216-2 ISO; 7 апреля 2013) 16,17 и были применены к обнаружению вируса гепатита А и норовируса весной вода 16. Все стандартные методы должны включать контроль производительности качество и критерии для сведения к минимуму внутри- и лабораторные изменения и ложные положительные данные из-за лабораторной загрязнения. Для дальнейшего снижения ложных данных, EПА Метод 1615 следующим образом руководство ЕРА на молекулярных методов, 18, ​​которая предусматривает разделение работы в течение обработки и один из способов работы потока. Она включает в себя гепатит гайанских 1,19 внутреннего контроля и процедур в целях минимизации ложные отрицательные результаты из-за ингибиторов RT-КПЦР 15. Он использует количественные анализы вместе с стандартизированных объемов воды, так и воды пробы анализируемого так, чтобы все поле данных выражается в геномных копий на литр области или питьевой воды пробы. Хотя эффективность одной трубкой (один шаг) ОТ-ПЦР коммерчески доступны, метод преднамеренно использует отдельные анализы. Это имеет тот недостаток, сводя к минимуму количество образца, который можно исследовать в каждой реакции, но дает большую гибкость в использовании нескольких наборов праймеров. RT-КПЦР анализы ограничены, и только так хорошо, как праймеры и зонды используются и, вероятно, не набор праймеров не будет обнаруживать все варианты вирусов в пределах группы. Набор энтеровирус грунт был выбран потому,он направлен консервативную 5&#39;-кодирующую область без, 20,21 обнаруживает широкий спектр энтеровирусов серотипов, а вирусы, обнаруженные ею связаны с эффектами на здоровье потребления необработанных подземных вод 1. Два набор праймеров используются для обнаружения геногруппы я Норовирусы 22,23. Первый был выбран из-за сильной корреляции между последствиями для здоровья у маленьких детей и обнаруживается вирус 1. Второй геногруппа я набор праймеров и набор праймеров для норовирусами геногруппа II были выбраны потому, что они обнаруживают самые разнообразные штаммы 24,25. Несмотря на основных преимуществ КПЦР и РТ-КПЦР процедур для обнаружения вирусной РНК в воде, есть несколько ограничений. Во-первых, оба инфекционных и неинфекционных вирусных частиц, в том числе инактивируется дезинфицирующими средствами, могут быть усилены этих процедур. Результаты Борхардт предположить, что это меньше проблем для необработанной подземных FROM водоносные горизонты, похожие на те, в общинах изучали, чем для вылеченных поверхностных вод 1. Для этого культивируемых вирусов проблема может быть преодолена с помощью ПЦР в сочетании с культурой 26,27. Проблема также рассматривалась для некоторых вирусов путем использования нуклеиновых кислот сшивающих агентов 28-30. Этот последний подход является более эффективным для вирусов инактивируют гипохлоритом и не эффективных для тех, инактивируется УФ. Второе ограничение этих молекулярных процедур является то, что объем Концентрированный образец, который может быть проанализированы, как правило, значительно меньше, чем при использовании процедур культура 6,31. Эта проблема часто обрабатываются либо заменой процедуру на основе гликоля полиэтилена для стандартной вторичной концентрации органическим флокуляции, что позволяет образец, который должен повторно суспендируют в меньшем объеме, или путем добавления третичного образца стадии концентрирования 6,32,33 , Метод использует Центробежная 1615мкгал ультрафильтрации, чтобы обеспечить высшее концентрации. Центробежный ультрафильтрации удаляет воду и компоненты меньше, чем 30000 дальтон результате в обоих концентрации любого вируса в опытных образцах и уменьшению низкомолекулярных ингибиторов массу молекулярного анализов. Это третичные шаг концентрация приводит к общему фактору концентрации&gt; 10 5 для любого вируса, который присутствует в воде проходит испытания. Третье ограничение является наличие ингибиторов молекулярных процедур в пробах окружающей среды. Несмотря на многочисленные подходы, чтобы удалить ингибиторы были разработаны, ни один подход не является эффективным для всех водных матриц и вирусных типов 6,34,35, что делает использование внутреннего контроля, предназначенных для оценки уровня ингибирования существенной. Гепатит G реагент, используемый в этом методе удовлетворяет этому требованию, обеспечивая постоянный уровень вирусной РНК во всех реакций и анализе ОТ-КПЦР для оценки ингибирования. Когда лучше тон ингибитора подходы удаления не удалить торможение, образец концентраты можно разбавить тех пор, как концентрации вируса выше, чем концентрации ингибитора 14,15. Стандартная процедура кривая описано здесь имеет свои преимущества и главное ограничение. Преимущество состоит в том, что реагент используется поставляет все необходимые компоненты в одном реагента, что позволяет одному управления, которые будут использоваться для всех анализов. Этот реагент особенно выгодно для норовируса анализов. Norovirus частицы могут быть получены только от инфицированных лиц, делающих его очень трудно получить вирусные частицы для использования в качестве стандартов. Более важное преимущество состоит в том, что он обеспечивает РНК стандарт для всех целевых РНК-содержащих вирусов в одном реагента, как имеющие стандарт РНК является существенным для точной количественной оценки РНК 36. Тем не менее, способность количественно вирус точно ограничен тем, что матричные эффекты не учтены. Это означает, что геномной копиичисловых значений, не может считаться абсолютным и должен рассматриваться только в относительном выражении. Рекомендуется достаточное количество стандартной кривой работы фондовых аликвоты (шаг 1.2) будет подготовлен для покрытия полных исследований. Например, каждый 250 мкл аликвоты обеспечивает достаточную реагент для 6 RT пластин. Если известно, что исследование потребует анализ 500 образцов, как минимум 12 аликвот было бы необходимо (500 образцов / 7 выборок в РТ пластины / 6 RT пластин в аликвоте). EPA Метод 1615 является метод, основанный производительности. Многие производители делают эквивалентные реагентов, указанным в данном документе, и эти реагенты могут быть заменены при условии, что критерии эффективности выполнены. Стандартную кривую, который также служит в качестве положительного контроля ОТ-КПЦР, имеет значение в устранении проблем производительности. Производительность может снижаться из-за деградации РНК, реагента срока годности, отказ морозильников, калибровка приборов и технических ошибок. Проблемы производительности должны быть подозреваемымред, если стандартные кривые отличаться от изображенного на рисунке 4, или если они не соответствуют спецификации производительности для стандартных кривых. RT-КПЦР анализ является достаточно надежным; полный провал, скорее всего, из-за неправильного обращения с РНК или технической ошибки (например, отсутствует реагент). Большое внимание должно быть принято в обработку образцов РНК между добычей и стадии РТ снижения деградации РНК из рибонуклеаз. Полиовируса восстановление из наземных и реактивами вод и мышиных норовируса извлечения из подземных вод встретил EPA Method 1615 критерии приемки производительности (таблица 11) и похожи на те, сообщалось другими 33,37,38. Мышиные Norovirus восстановление из образцов LFB были намного ниже, чем у полиовируса и не встретил бы полиовируса конкретных критериев приемлемости. Причины низкой мышиного восстановления норовируса из химически чистой воды неизвестны. Подобно результатам в данном документе, Карим и colleaдогадывался сообщил восстановление для норовируса GI.1 4% от водопроводной воды 39. Ли и др. 37 о средних извлечения для мышей норовируса и человеческого норовируса GII.4 18% и 26% от дистиллированной воды, используя дисковые фильтры, соответственно. Используя подобные условия в Ли и его коллеги, Ким и Ко наблюдается извлечения 46% и 43% для этих вирусов, соответственно 38. Gibbons др. 40 получена около 100% восстановление человеческого норовирусной GII.4 из морской воды, но Ким и Ко 38 обнаружено, что добавление соли к дистиллированной воде при концентрациях, аналогичных или выше морской воды значительно снижается возмещение мышиного вируса в результате и примерно в два-кратному снижению восстановления GII.4.

Количественная ПЦР (КПЦР, см дополнительные материалы для определений терминов, используемых в этой рукописи) и обратной транскрипции-КПЦР (RT-КПЦР) являются ценными инструментами для обнаружения и количественного определения энтеровирусов человека в окружающей среде и питьевой воды, и особенно для многих вирусов, которые делают не копировать или тиражировать плохо в системах клеточных культур. Оба инструмента показали, что многие вирусные типы присутствуют в окружающей среде и питьевых вод по всему миру 1-6. Их использование в сочетании с секвенирования амплифицированных геномных фрагментов во время болезни расследования вспышек предоставил доказательств для передачи вируса водной, так как они показали, что вирус найден в питьевой воде идентична той, пролитых вспышек пациентов 7-10. Оба КПЦР и РТ-КПЦР являются полезными инструментами общественного здравоохранения. Например, данные исследований, проведенных Агентством по охране окружающей среды США (EPA) показали прочные отношения бытьИзмерения подростковые индикатор по кПЦР и последствий для здоровья в рекреационных вод. В результате, окончательные 2012 Критерии отдыха качества воды EPA включает в себя метод КПЦР мониторинга отдыха пляжи 11,12. Борхардт и его коллеги также обнаружили сильную связь между острым гастроэнтеритом в общинах, используя необработанную грунтовые воды и вирус в грунтовых водах, как измеряется RT-КПЦР 1. Цель данной работы заключается в описании молекулярный компонент анализа в EPA Method 1615 13,14. Этот анализ использует RT-КПЦР, чтобы обеспечить количественную оценку энтеровирус и норовируса геномных копий (GC) за литр, основанной на первоначальный объем прошел экологическую или питьевой водой через электроположительной фильтра. Обзор молекулярной процедуры показан на рисунке 1 раздел. 1 Протокола детали процедуры подготовки стандартной кривой. Эти стандарты разрабатываются с реагентом, который содержит RNКопия целевой последовательности для всех грунт / зонд наборы. Раздел 2 описывает процедуру высшее концентрации. Раздел 3 дает процедуру для извлечения РНК из концентрированных водных и контрольных проб. РНК из каждого испытуемого образца обратной транскрипции с помощью трех экземплярах анализы и случайные праймеров к премьер транскрипции (раздел 4). КДНК из каждого реакции обратной транскрипции разделен на пять отдельных вирус-специфических анализов, которые анализируются в трех экземплярах КПЦР (раздел 5; Рисунок 2). Анализ использует праймеров и зондов с научной литературе (таблица 1), которые предназначены для обнаружения много энтеровирусы и норовирусами и реагентом, содержащим гепатита G РНК для идентификации испытуемых образцов, которые ингибируют RT-количественной ПЦР 15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#176;C cool brick</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BRIK-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N8080130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-346</td>
			<td>Must be a manual defrost freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70 &#176;C or colder freezer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MBF700LSAO-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armored RNA EPA-1615</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Used for quantifying the RT-qPCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armored RNA Hepatitis G virus</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>42024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Steris</td>
			<td>Amsco Lab Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>NuAir Laboratory Equipment Supply</td>
			<td>Labgard 437 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10856</td>
			<td>Crystalline grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AVE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026956</td>
			<td>Carrier RNA dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AVL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19073</td>
			<td>Extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier RNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Use carrier RNA supplied with Buffer AVL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-23 or 05-562-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotors</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339080, 336380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool safe box</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CSF-BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#174; 480 Probes Master kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>4707494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td>Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcide III</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>99R-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; film</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSA5001</td>
			<td>Heat resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;F&#39; film</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSA1001</td>
			<td>Freezer resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-plate spinner</td>
			<td>Labnet International</td>
			<td>MPS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-tube chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical reaction plate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4314320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR nucleotide mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade water</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3315932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>D9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>MicroPlate Genie</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative PCR thermal cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-381-27E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>367501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515 or N2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II or III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18064-022 or 18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-058-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4314879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator units</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>VS2022</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. part iii. virus detection by rt-qpcr

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Watch this Scientific Journal Video about EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR at JoVE.com

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA Метод 1615 Измерение энтеровирус и Норовирус Происшествия в воде культуры и РТ-КПЦР. Часть III. Обнаружение Вирус РТ-КПЦР

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Research

JoVE Journal

Environment

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Малый Порядок громкости для концентрации вируса из воды

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 Измерение энтеровирус и Норовирус Происшествия в воде культуры и RT-КПЦР. I. Сбор образцов вирусов

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

EPA Метод 1615. Измерение энтеровирус и Норовирус встречаемости в воде культуры и РТ-КПЦР. II. Итого культивируемых Вирус Анализ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Удаление микроэлементов в оксид меди наночастиц из урана<em&gt; На месте</em&gt; Восстановление Кровотечение воды и ее влияние на Жизнеспособность

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

VacuSIP, усовершенствованный метод InEx<em&gt; В Ситу</em&gt; Измерение частиц примесей и растворенных веществ Обработанные Активные сестонофагов

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Метод липидной экстракции и анализа для характеристики микробов почвы в экспериментах со многими образцами

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

Оптимизированная процедура определения адсорбции фосфонаты на гранулированный гидроокисью железа с помощью миниатюрных метод определения фосфора

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Обнаружение тилапии озеро вирус с помощью обычных RT-PCR и SYBR зеленый RT-ПЦР

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Microplot Дизайн и завод и почва Пример подготовки к 15анализа азота

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Обнаружение фитофторы капсиди в оросительной воде с помощью loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...