Name: high-throughput quantitative real-time rt-pcr assay for determining expression profiles of types i and iii interferon subtypes
Uploaded: 2015-03-24T16:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل CBER / FDA-NIAID / NIH المشتركة بين الوكالات اتفاق YI-AI-6153-01، وصناديق جماعية FDA / CBER، ومبادرة المضادة الطبية FDA. TCT، MNB، VPM، LMS، وتم دعم KDK التي كتبها موعد لبرنامج المشاركة البحوث في مركز التقييم البيولوجي والأبحاث من قبل معهد أوك ريدج للتربية والعلوم تدار من خلال اتفاق بين الوكالات بين الأقسام الأدبية الطاقة في الولايات المتحدة والولايات المتحدة إدارة الغذاء والدواء.

<ol>
	<li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+antiviral+immunity.">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li><li>Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons,+interferon-like+cytokines,+and+their+receptors.">Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors.</a> Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).</li><li>Baum, A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+by+RNA+viruses:+cellular+receptors+and+their+substrates.">Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates.</a> Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).</li><li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambdas+mediate+antiviral+protection+through+a+distinct+class+II+cytokine+receptor+complex.">IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.</a> Nature. 4, 69-77 (2003).</li><li>Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+type+I+interferon+locus+and+identification+of+novel+genes.">Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes.</a> Genomics. 84, 331-345 (2004).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNbeta-dependent+increases+in+STAT1,+STAT2,+and+IRF9+mediate+resistance+to+viruses+and+DNA+damage.">IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage.</a> The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).</li><li>Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-stimulated+genes:+a+complex+web+of+host+defenses.">Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses.</a> Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).</li><li>Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+the+nuclear+factor-kappaB+pathway+and+the+innate+immune+response+by+viruses.">Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses.</a> Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).</li><li>Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+soluble+alpha/beta+interferon+(IFN)+receptor+binds+to+the+cell+surface+and+protects+cells+from+the+antiviral+effects+of+IFN.">The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN.</a> Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+I+and+type+III+interferons+by+a+secreted+glycoprotein+from+Yaba-like+disease+virus.">Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).</li><li>Bidwell, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Irf7+pathways+in+breast+cancer+cells+promotes+bone+metastasis+through+immune+escape.">Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape.</a> Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).</li><li>Di Domizio, J., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+autoimmunity:+type+I+interferon+in+autoimmune+diseases.">Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases.</a> Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).</li><li>Crow, Y. J., Casanova, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING-Associated+Vasculopathy+with+Onset+in+Infancy+-+A+New+Interferonopathy.">STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy.</a> The New England journal of medicine. , (2014).</li><li>Bermel, R. A., Rudick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-beta+treatment+for+multiple+sclerosis.">Interferon-beta treatment for multiple sclerosis.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).</li><li>Kingham, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+HBsAg-positive+chronic+active+hepatitis+with+human+fibroblast+interferon.">Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon.</a> Gut. 19, 91-94 (1978).</li><li>Heathcote, J., Main, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+hepatitis+C.">Treatment of hepatitis C.</a> Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).</li><li>Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-lambda+and+therapy+for+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection.</a> Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).</li><li>Castaigne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+in+the+treatment+of+hairy+cell+leukemia.">Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia.</a> Cancer. 57, 1681-1684 (1986).</li><li>Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interferon-alpha+in+chronic+myeloid+leukemia.">Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia.</a> The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+on+NZM2328.Lc1R27:+Enhancing+autoimmunity+and+immune+complex-mediated+glomerulonephritis+without+end+stage+renal+failure.">Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure.</a> Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).</li><li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha+Acts+on+the+S/G2/M+Phases+to+Induce+Apoptosis+in+the+G1+Phase+of+an+IFNAR2-Expressing+Hepatocellular+Carcinoma+Cell+Line.">Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line.</a> The Journal of biological chemistry. , (2014).</li><li>Xia, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IFN-alpha-Producing+Plasmacytoid+Dendritic+Cells+(pDCs)+in+Human+Th1-Mediated+Type+1+Diabetes:+pDCs+Augment+Th1+Responses+through+IFN-alpha+Production.">Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production.</a> Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).</li><li>Hervas-Stubbs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+but+not+plasmacytoid+dendritic+cells+foster+the+systemic+virus-induced+type+I+IFN+response+needed+for+efficient+CD8+T+cell+priming.">Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming.</a> Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).</li><li>Manry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+genetic+dissection+of+human+interferons.">Evolutionary genetic dissection of human interferons.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).</li><li>Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relatedness+among+the+type+I+interferons.">Diversity and relatedness among the type I interferons.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).</li><li>Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genomic+data+in+the+discovery,+annotation+and+evolutionary+interpretation+of+the+interferon-lambda+family.">The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family.</a> PloS one. 4, e4933 (2009).</li><li>Hillyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+human+interferon-alpha+and+interferon-lambda+subtypes+are+ligand-+and+cell-dependent.">Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.</a> Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).</li><li>Schramm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+array+for+absolute+and+relative+quantification+of+rhesus+macaque+types+I,+II,+and+III+interferon+and+their+subtypes.">High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).</li><li>Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+of+xeno-nucleic+acid+for+detecting+nucleic+acid.">Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid.</a> Theranostics. 3, 395-408 (2013).</li><li>Little, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification-refractory+mutation+system+(ARMS)+analysis+of+point+mutations.">Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations.</a> Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).</li></ol>

VPM and RLR are co-inventors of the technology to measure expression of IFN- and IFN- subtypes and derive royalty income from it. The remaining authors declare no conflict of interest.

ويصف هذا التقرير التصميم والإنتاج دفعة، وهذا النهج نحو تحليل لفحص لقياس النسخ من مجموعة من الجينات مماثلة إلى حد كبير في إعداد مختبر الأبحاث. الفحص QRT-PCR عالية الإنتاجية ذكرت هنا يقيس IFN- و- فرعية λ مع خصوصية عالية. يتضمن هذا الأسلوب جانبين رئيسيين، وتصميم مجموعات العلاقات العامة / الرصاص التي تميز بين أفراد من عائلة الجينات المتماثلة وتطوير منصة الإنتاج لخلق لوحات فحص 384 جيدا موثوقة ومتسقة مسبقة مع مجموعات العلاقات العامة / الرصاص. تحقيقات QRT-PCR تشتمل على (MB) أو كيميائية (LNA) النهج الهيكلي نحو تعزيز خصوصيتها 29. لاثنين من مجموعات التمهيدي في مقايسة هندي صغير (الجدول 2)، وقد أدرج النظام الطفرة التضخيم صهر (ARMS) في تسلسل التمهيدي لمواصلة تعزيز خصوصية 30. في حين كان من عادة أفضل لاستهداف تقاطعات اكسون-اكسون لenhaالامتحانات التنافسية الوطنية خصوصية رد فعل QRT-PCR، وكان هذا غير ممكن لأن النوع الأول الإنترفيرون الجينات تفتقر الإنترونات. لذلك، سوف تتضخم الحمض النووي الجيني في رد فعل PCR، ويجب أن تدهورت بفعل العلاج الدناز بعد استخراج الحمض النووي الريبي. كان مقتصرا على المنطقة المستهدفة لمجموعات العلاقات العامة / الرصاص إلى المناطق الترميز من الببتيد ناضجة لكل IFN. بسبب تشابه تسلسل عالية بين الأنواع الفرعية-α IFN، وخاصة في المنطقة الببتيد ناضجة، كان من الضروري في بعض الأحيان للتنازل حساسية لضمان خصوصية. كان هذا هو الحال بصفة خاصة مع IFN-α17، حيث الببتيد نسخة ناضجة لديها سوى أربعة قواعد فريدة بالمقارنة ضد أخرى فرعية IFN-α. استهداف IFN-α17 المطلوبة الاشعال التي تربط بين نصوص فرعية متعددة، وتقييد خصوصية إلى التحقيق. ونتيجة لذلك، فإن رد فعل PCR تضخيم أنواع فرعية أخرى من الإنترفيرون α17، وبالتالي تستهلك نسبة كبيرة من الكواشف PCR وloweriنانوغرام اتساع إشارة مضان من التحقيق محدد لIFN-α17. تحديا إضافيا نحو تصميم مجموعات العلاقات العامة / الرصاص حساسة ومحددة لجينات مشابهة إلى حد كبير مثل IFN هو إمكانية أن تسلسل المشروح في قاعدة بيانات بنك الجينات قد لا تكون كاملة أو شاملة في وقت التصميم. مرة أخرى، كان هذا تحديا لIFN-α17، التي متواليات المشروح حديثا لا تتفق تماما مع إصدار تسلسل في قاعدة البيانات في وقت التصميم. لذلك، عند تصميم العلاقات العامة / الرصاص يحدد الجينات التي لم يتم دراستها بشكل مكثف، فإنه من الحكمة أن تحقق بشكل دوري على أحدث تسلسل المشروح من الجين المستهدف. وأخيرا، لا بد من التأكد من أن مجموعات العلاقات العامة / الرصاص لا تضخيم الكاذبة التي يمكن نسخها ولكن لا تترجم. بعد تصميم مجموعات العلاقات العامة / الرصاص، فإن التحدي التالي هو الأمثل الظروف PCR من سبعة عشر مختلف العلاقات العامة / الرصاص يضع على واحد لوحة 384 جيدا. المعايير هي نسخة المجمدةتانت في اختبار خصوصية مجموعة العلاقات العامة / الرصاص وتصبح ضرورية لمواءمة الظروف QRT-PCR العديد من ردود الفعل PCR مختلفة. اختبار مجموعة العلاقات العامة / الرصاص ضد معايير النص يؤسس كفاءتها وحساسية. البلازميدات التي تعبر عن الكاذبة مماثلة للغاية قد تكون ضرورية لضمان أن العلاقات العامة / الرصاص ضبط يقيس بشكل انتقائي نسخ من الجين وظيفية. كما توفر معايير النص وسيلة الكمية للتحليل (عدد النصوص)، بالإضافة إلى تحليل نسبة شبه الكمية لجين التدبير المنزلي (ΔCq). الروبوتية pipetting لمتعددة من لوحة مصدر 96-جيدا الى عدة 384-جيدا لوحات فحص يحسن من دقة واتساق النتائج المشترك بين لوحة. ويستخدم الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية (SSDNA) باعتبارها الناقل أن تستقر ويحافظ على مجموعات العلاقات العامة / الرصاص للتخزين على المدى الطويل، وكذلك تجفيف الكواشف الاستغناء في لوحات. تجفيف لوحات أيضا يقلل من حجم رد الفعلالضرورة من أجل تحقيق النتائج استنساخه، والذي بدوره يحافظ على عينات الثمينة ويقلل من استخدام الكواشف مكلفة. من خلال هذه الخطوات، يتم تجميع دفعات من لوحات التي توفر الدقة والاتساق لأكثر من ستة أشهر. وبعد إعداد لوحة، وتدابير مراقبة الجودة حاسمة للتحقق من اتساق مجموعة من لوحات. لهذا الغرض، يتم تشغيل على أربع مجموعات إضافية من المعايير على طبق من ذهب. لوحة &quot;المعيار 5X&quot; مسارات الأداء ويخلق مجموعة من البيانات التي تتم مقارنة معايير لوحة الفرد. في حين تستخدم عشرة التخفيفات 10 أضعاف من كل معيار خلال تصميم الفحص، تتطلب اعتبارات المساحة التي أربع نقاط وتستخدم لمنحنى قياسي على كل لوحة الفحص، وبالنسبة للوحة القياسية 5X. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تدرج تحكم إيجابية على كل لوحة لضمان صحة اللوحة. عادة، فإنه يأخذ 3-4 ساعة لإعداد ست لوحات فحص من أحد العلاقات العامة / الرصاص الصورةلوحة ource. فمن الممكن لإعداد اثني عشر لوحات في يوم واحد في مختبر الأبحاث. لأن كل لوحة IFN النوع الفرعي فحص الإنسان تدرس سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويمكن أن تستوعب خمسة عشر العينات التجريبية، يوم واحد من التجمع تنتج مجموعة من لوحات لديها القدرة على توليد ما يصل إلى 3،060 نقاط البيانات التجريبية. يمكن معالجة البيانات الخام من منصة QRT-PCR وتجميعها باستخدام البرامج النصية البرمجة في برنامج تطبيق جدول لملء قالب تحليل المصممة مسبقا تلقائيا. هذا الأسلوب يقلل التدريب العملي على إدخال البيانات، وبالتالي منع أخطاء النسخ ويسمح للمحقق للتركيز على تحليل البيانات بدلا من تجميع البيانات. كما هو موضح هنا، وهذا QRT-PCR فحص عالية الإنتاجية يمكن تطبيقها لقياس التعبير عن الأنواع الفرعية فيروسات في عينات المكاك البشري أو هندي صغير ويمكن أن تتكيف مع استخدام لأنواع أخرى أو مجموعات الجينات المتماثلة. المرونة في تخطيط لوحة تسمح للمستخدم لتغيير التمهيدي / مسبار يحدد لتكييف جيناتالفائدة نحو نوع من الخلايا معين أو نظام نموذجي. هذا الاختبار يمكن تطبيقها لقياس IFN التوقيعات التعبير في نماذج ثقافة الخلية دراسة مسببات الأمراض أو في عينات من المرضى في سياق نماذج المرض لتوضيح آليات إشارات تشارك في الاستجابة المناعية.

أنواع الأول والثالث إنترفيرون (IFN) هي الحاسمة في الاستجابة المناعية للفيروسات والمحفزات الأخرى المسببة للأمراض والحاضر في جميع الفقاريات 1. الخلايا المناعية وغير المناعية تعبر عن وتفرز، فضلا عن الاستجابة ل، IFN 2. أجهزة الاستشعار المناعية الفطرية، مثل مستقبلات تول مثل (TLR)، STING، وRIG-I، لحث النوع الأول والثالث IFN التعبير عند الكشف عن العوامل المسببة للأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMP) 3،4. في البشر، النوع الأول الإنترفيرون تشمل IFN-β، -ω، -κ، و 12 أنواع فرعية من IFN-α، وربط لمستقبلات IFNAR1 / IFNAR2 معقدة 2،5. النوع الثالث IFN تشمل IFN-λ1، -λ2، و-λ3 وربط مجمع مستقبلات IL10RB / IL28RA 2. كلاسيكيا، وأنواع الأول والثالث IFN ربط إلى المجمعات مستقبلات منها والتي ثم تجنيد STAT1 / heterodimers STAT2 وبدء النسخ من الإنترفيرون حفز الجينات (ISG) 6. وتشارك ISG في مجموعة متنوعة من الوظائف، من فيروسات ومضادةالنشاط التكاثري لتفعيل الاستجابة المناعية التكيفية 7. آليات عديدة تطورت مسببات الأمراض للتهرب، تخريب، وخطف عناصر من مسار IFN إشارات تدل على أهمية IFN في الاستجابة المناعية الفطرية 8. على سبيل المثال، فيروس اللقاحية يعبر عن مستقبلات شرك مع IFNAR1 التماثل أن تعزل اكتب I الإنترفيرون 9 في حين أن فيروس المرض يابا مثل يفرز بروتين سكري الذي يمنع اكتب الأول والثالث IFN البروتينات 10. بالإضافة إلى دورها في الدفاع المضيف، وتورط IFN أيضا في مراقبة السرطان وعدد من الأمراض الالتهابية السيارات: إسكات التعبير IFN في خلايا سرطان الثدي يقيد الترصد المناعي 11، الإفراط في IFN-α هو آلية في تطوير النظامية الذئبة الحمامية 12، وتفعيل المخطئين من STING يؤدي إلى التهاب النظامية الناجمة عن كميات مفرطة من IFN في المصاحب STING اعتلال وعائيوتستخدم 13. العلاجي، IFN لعلاج التصلب المتعدد 14، والالتهابات الفيروسية المزمنة مثل HBV 15 و HCV 16،17، والسرطانات مثل اللوكيميا خلية شعر 18 و ابيضاض الدم النقوي المزمن (19). أسئلة حول أهمية IFN في عملية فسيولوجية معينة تكشف باستمرار طبيعة في كل مكان من هذه العائلة خلوى. اكتب I IFN، وخاصة الأنواع الفرعية-α IFN، وغالبا ما تعتبر واحدة كيان 20-23، بدلا من أن تكون مجموعة من يرتبط ارتباطا وثيقا، ولكن متميزة، والبروتينات. وجود واستمرار الأنواع IFN متعددة بما في ذلك الأنواع الفرعية IFN-α، في جميع أنحاء تطور الفقاريات 24 تشير إلى أن ما لا يقل عن مجموعة فرعية من هذه الأنواع الفرعية لها وظائف محددة أو فريدة من نوعها. ومن الممكن أن أنماط المميزة لIFN التعبير وفك وتساعد على توصيف وظائف محددة من واحد أو أكثر من أنواع فرعية 17. التحدي المتمثل في دراسة ركان النوع الأول والثالث IFN فرعية تقوم على هوية مشتركة تسلسل منهم: اثني عشر فرعية IFN-α تشترك&gt; 50٪ 25 و الأنواع الفرعية-IFN λ حصة 81-96٪ 26 من سلاسل من الأحماض الأمينية الخاصة بهم. في وصف QRT-PCR الفحص، منارة الجزيئية (MB) والحمض النووي مؤمن (LNA) تحقيقات الفلورسنت تميز الاختلافات زوج قاعدة واحدة بين مماثلة إلى حد كبير تسلسل IFN النوع الفرعي وتسمح لتوصيف التوقيع IFN التعبير. ويشمل 384 جيدا شكل لوحة الفحص على حد سواء الكمية (معايير النص) وشبه الكمية (الجينات التدبير المنزلي (HKG)) تدابير، والسماح لتحليلها من قبل عدد نسخ النص وΔCq على التوالي. التجمع دفعة، سهلت الآلي pipetting لمتعددة القنوات، والتخزين على المدى الطويل، ممكن من خلال تجفيف التمهيدي / مسبار (العلاقات العامة / الرصاص) يضع على لوحات، وتعزيز استنساخ، والمرافق، والتطبيق العملي للمقايسة. يصف هذا البروتوكول عمليةلإعداد لوحات 384 جيدا QRT-PCR فحص (الشكل 1) مع ما يصل الى سبعة عشر مجموعات مختلفة العلاقات العامة / الرصاص استهداف فرعية IFN الإنسان (الجدول 1). ضبط العلاقات العامة / الرصاص العمل وتستخدم لوحات مصدر الأوراق المالية (الشكل 2) لإعداد متعددة 384 جيدا لوحات الفحص في عملية يمكن أن يكون آليا باستخدام متعددة القنوات pipettor الروبوتية. في حين كان التركيز في البداية على خلق بروتوكول لدراسة IFN التوقيعات التعبير الإنسان، وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لقرود المكاك ريسوس كذلك. على الرغم من أن تخطيطات لوحة مختلفة قليلا ومجموعات العلاقات العامة / الرصاص (الجدول 2) ومتميز، وطريقة إعداد الكلي لخلق لوحات البشرية والقرد هو متطابقة. مع تعديلات طفيفة على البروتوكول، يمكن تنفيذ طريقة للسماح لتطوير المقايسات لدراسة مجموعات أخرى من الجينات ترتبط ارتباطا وثيقا. انظر الشكلين 1 و 2 أدناه انظر الجدولين 1 و 2 بيلآه

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1824">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;"></td>
			<td style="width:668px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:531px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2mL PCR Tube Strips&#160;</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>E0030 124 286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-139</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-137</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel Electronic Pipette, 5-250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td style="width:141px;">14-387-118</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile</td>
			<td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td>
			<td>229446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-115</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td>
			<td>89094-668</td>
			<td>25mL reservoirs with 2 dividers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-Centrifuge</td>
			<td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td>
			<td>1090003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eukaryotic 18S rRNA (18S)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixed Speed Mini Vortexer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gas Permeable Adhesive Plate Seal</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td>Disposable plate seal used during the plate preparation process&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Rh02621745_g1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hudson Solo automated multichannel pipettor&#160;</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800200</td>
			<td>Modified with a 384-well cooling nest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Linearized plasmids (IFN genes)</td>
			<td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 3000, 3580; used for assay standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA inhibitors</td>
			<td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 500100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA Probes</td>
			<td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Material number VC00023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsoft Excel 2010 Spreadsheet</td>
			<td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&#160;</td>
			<td>Office 2010</td>
			<td>Visual Basic programming language&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate Vortex Mixer</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>5353 000.014</td>
			<td>2 dimensional plate vortex apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Beacon Probes</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Dryer (manifold)</td>
			<td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primer sets</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC57 plasmid DNA</td>
			<td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>SD1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase H</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td>
			<td>M0297L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800350-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SoftLinx Version V</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Software for programming pipetting steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ABgene Adhesive Plate Seals&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Ubiquitin C (UBC)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs01871556_s1</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Verso cDNA synthesis Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-Ultra Pure</td>
			<td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td>
			<td>351-029-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zipvap 384 (plate dryer heating element)</td>
			<td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td>
			<td>384-109A</td>
			<td>Plate Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative real-time rt-pcr assay for determining expression profiles of types i and iii interferon subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

وصف فحص QRT-PCR يمكن تنفيذها لتحليل أنماط التعبير من أنواع الأول والثالث IFN في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا والسياقات. على سبيل المثال، تم تحليل نوع I بشر والثالث IFN التوقيعات التعبير في خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) من حفزت 6 المانحين مع يغاندس TLR. بولي I: C (25 ميكروغرام / مل)، LPS (10 نانوغرام / مل)، إميكويمود (10 ميكرون)، و[أليغنوكليوتيد الدليل السياسي الشامل (1 ميكرومتر) (الشكل 4). وقد تم تحليل البيانات باستخدام برنامج تطبيق جداول البيانات وعرضها كما الخرائط الرادارية مع الأنواع الفرعية IFN-α رتبت في اتجاه عقارب الساعة وفقا لشجرة النشوء والتطور من تسلسل البروتين 27. يتم عرض الرسوم البيانية رادار التعبير IFN البشري في نطاق وسجل حسابها باستخدام طريقتين مختلفة من التحليل دمجها في تصميم فحص: القيمة المطلقة CQ تطبيع لHKG (ΔCq)، ونسخ عدد من القالب في ميكروغرام (ميكروغرام) من إجمالي RNA . يتم حساب القيم في عدد النسخ من نتائج س<html> منحنى اتحاد كرة القدم نسخة القياسية. تظهر البيانات أن التوقيعات التعبير IFN الإنسان التي تسببها منبهات TLR محددة يجند. انظر الشكل 4 أدناه كما تبين للتوقيعات IFN التعبير الإنسان، الأول والثالث IFN في قرود المكاك ريسوس كنا التوقيعات التعبير من أنواع أيضا TLR يجند محدد. وقد حفز PBMC من 3 المانحين مع بولي I: C (50 ميكروغرام / مل)، LPS (10 ميكروغرام / مل)، وإميكويمود (10 ميكروغرام / مل) لمدة 3 ساعة (الشكل 5). كان IFN النوع الفرعي التعبير في الخلايا unstimulated في الأساس منخفضة. وأعرب عن عدد محدود من IFN- فرعية ردا على LPS وبولي I: C. في المقابل، كان IFN التعبير ردا على إميكويمود عالية وكان التعبير النوع الفرعي واسع. تم تعزيز التعبير عن الإنترفيرون β وIFN-λ1 من قبل جميع TLR ثلاثة منبهات 28. انظر الشكل 5 أدناه دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> الشكل 1: تخطيط لوحة 384 جيدا الفحص مع سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص الهدف رقم يشير إلى مجموعة العلاقات العامة / الرصاص. يتم إضافة منحنيات القياسية أربع نقاط (المثلث الرمادي الداكن) إلى الأعمدة 1-5. يتم إضافة مجموعات HKG العلاقات العامة / الرصاص (خلفية بيضاء) إلى أعمدة 6 و 7. الأعمدة المتبقية، 8-24، هي محددة لواحدة من سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص. يتم إضافة عينات لصفوف AP، من أعمدة 6-24 (الأسهم السوداء). وبئرين (O5، P5) في الجزء السفلي من العمود 5 تتلقى الماء فقط ومزيج الرئيسي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> الشكل 2: تخطيط لوحة مصدر 96-جيدا مع سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويشير العدد المستهدف إلى العلاقات العامة / الرصاصتعيين. السهام السوداء تمثل عند إضافة مجموعة العلاقات العامة / الرصاص إلى الآبار متعددة. تضاف يمزج المجلس الوطني الانتقالي إلى الآبار المعينة (خلفية رمادية داكنة). وبئرين (F3، G3) مع الخطوط القطرية غير المستخدمة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> الشكل 3: تخطيطي من الخطوات المحددة في البروتوكول فحص QRT-PCR AE الرسم البياني اختيار أجزاء من البروتوكول. (A) الخطوة 1: إعداد التخفيفات التسلسلية القياسية. (ب) الخطوة 2: إعداد العلاقات العامة / الرصاص وNTC يمزج الأسهم العمل. (C) الخطوة 3.1: إعداد الأسهم لوحة العمل 96-جيدا من مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويمزج المجلس الوطني الانتقالي. (D) الخطوة 4،1-3: إعداد يمزج لتحميل لوحة فحص 384 أيضا. (Estالجيش الشعبي 4.5: تحميل لوحة فحص 384 أيضا. وقراءة الرسوم البيانية من أعلى اليسار إلى أسفل الزاوية اليمنى. يتم تخزين الكواشف لفيروسات (IFN) فحص في -20 درجة مئوية ومدرجة في العمود الأيسر. خطوط إجراءات منفصلة في البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> يختلف توقيع IFN التعبير البشري في خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) ردا على بروابط TLR تستخدم لتحفيز PBMC وحفز مع يغاندس TLR وكان حصادها RNA لتحليل QRT-PCR: الشكل 4. وسائل هندسية الردود الذروة إلى بولي I: C (25 ميكروغرام / مل) في 8 ساعة (المربعات الحمراء)، LPS (10 نانوغرام / مل) في 4 ساعة (مثلثات خضراء)، إميكويمود (10 ميكرومتر) في 16 ساعة ( الماس الأرجواني)، الدليل السياسي الشامل (1 ميكرومتر) فيوترد 16 ساعة (الدوائر السوداء)، والسيطرة unstimulated في 16 ساعة (الدوائر الزرقاء) في الفترة من 6 المانحين في سجل 10 الحجم بوصفها وظيفة من التعبير عن HKG UBC ΔCq (يسار) أو رقم نسخة لكل ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (يمين) . يتم ترتيب الأنواع الفرعية IFN-α فقا لمؤامرة النشوء والتطور من الأحماض الأمينية تسلسل التشابه. وقد نشر هذا الرقم في الأصل في علم المناعة وعلم الأحياء الخلوي 27. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> الشكل 5: يختلف المكاك ريسوس IFN توقيع التعبير في خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) ردا على بروابط TLR تستخدم لتحفيز PBMC من ثلاثة قرود المكاك ريسوس (المعين من قبل مربع، والماس، والمثلث) تم عزل من الدم الكامل و حفز مع lipopolysaccharide في (LPS) (10 ميكروغرام / مل)، وبولي I: C (50 ميكروغرام / مل) أو إميكويمود (10 ميكروغرام / مل). تم حصاد الخلايا في 0 ساعة (مكتب مستشار رئيس الوزراءن الأشكال) أو بعد 3 ساعات من التحفيز TLR (الأشكال المغلقة) لقياس IFN التعبير. يتم عرض مستويات النص من النوع I، II، III وIFN في سجل 10 الحجم بوصفها وظيفة من التعبير عن HKG GAPDH ΔCq (يسار) أو نسخة رقم / ميكروغرام RNA (يمين). وقد نشر هذا الرقم أصلا في مجلة الانترفيرون وخلوى بحوث 28. <img alt="الجدول 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> الجدول 1: IFN البشري التمهيدي / مسبار مجموعة سلاسل ورد فعل من المعلومات <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.</a> <img alt="الجدول 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> الجدول 2: مكاك ريسوسي IFN التمهيدي / مسبار مجموعة سلاسل ورد فعل من المعلومات <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> تركيز البلازميد (FM) </td></tr><tr><td></td><td> A </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> الجدول 3: المعلومات تركيز مجموعة التخفيف القياسية. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> مجموعات IFN العلاقات العامة / الرصاص وأضافت </td><td> حجم الماء المضاف (مل) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β، -ω، -λ3 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1، -α5 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6، -α8، -α10 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14، -α16 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21، -λ1 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114.3 </td></tr></tbody></table> الجدول 4: NTC الأسهم العمل يمزج المعلومات.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes at JoVE.com

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes (Video) | JoVE

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells (Video) | JoVE

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Video) | JoVE

?????? PCR ????? ??????? ?? ?????????? ????? ???????? ????? ?? ????? ??? ?????? ?? ????????? ??????<em&gt; ???????? ????????? ???????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses (Video) | JoVE

زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity (Video) | JoVE

إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي، اختبار مزدوج قراءات من بين الخلايا مضادات الميكروبات آخر وحقيقية النواة السمية لخلايا

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules (Video) | JoVE

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles (Video) | JoVE

حبة على أساس مقايسة متعدد لتحليل الملامح سيتوكين المسيل للدموع

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material (Video) | JoVE

في الوقت الحقيقي مهتز الناجمة عن تحويل الفحص للكشف عن البريونات CWD في المواد البرازية

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning (Video) | JoVE

تحديد أنواع فرعية اللمفاويات باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة خالية من التسمية وآله التعلم

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay (Video) | JoVE

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis (Video) | JoVE

Pan-lyssavirus في الوقت الحقيقي RT-PCR لتشخيص داء الكلب

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...