Name: utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health verleent 5T32AI7493-20 en 5R01AI089337-03. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.

De universiteit van Alabama in Birmingham Institutional Animal gebruik en onderhoud goedgekeurd het gebruik van muizen als hierin beschreven onder het goedgekeurde protocol nummer 101.109.272. 1. Genetische Constructie van een gewijzigd Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 met de Antigen Capsid-Incorporation Strategy <ol><li> De bouw van de shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S <ol><li> Bestel een plasmide dat het gesynthetiseerde DNA-sequentie HVR1-KWAS tuss...

<ol>
	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

De toepassing van de traditionele transgen strategie Ad5 modificatie voor de ontwikkeling van vaccins is afgenomen voornamelijk door de bottleneck in verband met de Ad5 PEI 4,6. Dit knelpunt kan gedeeltelijk worden verminderd door toepassing van de alternatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie (figuur 1A), aangezien deze strategie neutralisatie kan omzeilen door Ad5 NAbs door het vervangen van neutraliserende epitopen van Ad5 met antigenen-of-interest, en het genereren van robuuste imm...

Human adenovirus (Ad) is een middelgrote, niet-omhulde virus met een icosahedraal nucleocapside met een dubbelstrengs DNA-genoom. Ad behoort tot de familie Adenoviridae, met een indeling in zeven groepen (A tot G). Elke groep bevat virus van verschillende serotypen. Waarvan adenovirus serotype 5 (Ad5) uit groep C is het meest uitgebreid bestudeerd en de meest gevraagde vectored benaderingen zoals gentherapie en vaccinatie. De traditionele transgen strategie ontwikkeld en toegepast voor Ad5 modificaties die wordt gekenmerkt door de verplaatsing van het virus vroege genen met een gen-van-belang en de gerichte expressie van het gen-van-belang in een gastheer. Voorbeelden zijn de aanleg van pENV9 / Ad5hrΔE3 door vervanging vroege gen 3 (E3) met rev-gen van Simian Immunodeficiency Virus 1, de opbouw van AdCMVGag door vervanging vroege gen 1 (E1) met het gag-gen van Human ImmunodeficiencyVirus (HIV) 2 en de constructie van Ad lacZ door vervanging E1 met lacZ gen 3. De brede toepassing van de traditionele transgene strategie op Ad5 afhankelijk van de volgende voordelen: het brede scala van gastheren voor Ad5, het haalbare gentechniek op virus en virus vermeerdering, de grote accommodatie van vreemd gen insert en de veiligheid van Ad5 4,5. De verminderde efficacies van Ad5-gevectoriseerd klinische therapieën met behulp van deze strategie is een belangrijk knelpunt, die is toegewezen aan voornamelijk geassocieerd met Ad5 PEI, aangezien Ad5 zo voorkomt onder de meeste kinderen en volwassenen 4,6. Om de belangrijkste bottleneck van Ad5 te overwinnen, het primaire doel is om een ​​alternatieve strategie te omzeilen Ad5 PEI ontwikkelen. Aangeboren immuniteit 7, adaptieve immuniteit zoals neutraliserende antilichamen (NAbs) 8-10 en CD8 + T cel responsen 10 tegen Ad5 is aangetoond dat contribute tot Ad5 PEI, met Ad5 NAbs verschijnen aan de dominante rol in de bijdragen spelen om Ad5 PEI 10,11. Bovendien Ad5 NAD doelepitopen in capside-eiwitten, waaronder de voornaamste eiwit hexon, fiber en penton basis. Waarvan, hexon is het belangrijkste doelwit van Ad5 NAbs 8,11-13. Gebaseerd op deze bevindingen, is een innovatieve Antigeen capside-Incorporation strategie ingevoerd. Deze nieuwe strategie benadrukt de vervanging of incorporatie van eiwitten-of-rente op Ad5 capsideproteïnen, die verschuift of maskeert de Ad5 neutraliserende epitopen, wat leidt tot de verminderde erkenning door de NAbs en efficiënte Ad5 vector administraties. Het is opmerkelijk dat deze strategie concurrerend omdat het kan ook helpen systemen wekken sterke humorale immuniteit en krachtige cellulaire immuniteit door direct presenteren antigenen-plaats aan het immuunsysteem 4,14,15. Op basis van deze strategie kan de moleculaire klonering en recombinante virale vector Ad rescue structureel verdeeldin vier hoofdstappen: (a) de bereiding van gen-plaats-fragment door een polymerase kettingreactie (PCR) of synthese; (B) het ligeren van het genfragment in een shuttle plasmide dat het fragment gen-plaats en homologe armen een adenovirus skelet bevat; (C) de homologe recombinatie door co-transformatie van de shuttle plasmide dat het gen-van-belang-fragment met de gelineariseerde plasmide backbone pAd5 / ΔH5 (AR) 16; (D) de transfectie van lineair recombinante adenovirale plasmide aan de recombinante Ad vector opgenomen met antigenen-of-interest redden. Onze groep en enkele anderen hebben deze alternatieve Ad integratie strategie voor Ad vectored ontwikkeling van vaccins tegen verschillende besmettelijke ziekteverwekkers verlengd. We meldden het genereren van een recombinante Ad vector Ad-HVR1-LGS-His 6-V3 doordat een His-gemerkte HIV-1 antigen V3 in het HVR1 locale van Ad5 hexon (hexon5). Dit gegenereerde vector geactiveerd strong humorale immuunrespons specifiek voor de V3 epitoop 4. We meldden ook de ontwikkeling van Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 door het opnemen van HIV-1 membraanproximale ectodomain gebied (MPER) in de HVR2 locale van hexon5 2. Daarnaast heeft het team van Dr. Zhou de voordelen van deze Ad opneming strategie gebruikt om Ad serotype 3 (Ad3) gevectoriseerd vaccins ie. Ontwikkelt, de vorming van virale vector R1SP70A3 doordat een neutraliserende epitoop SP70 enterovirus 71 in het HVR1 van Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 gegenereerde sterke NAbs en IFN-γ productie specifiek voor het epitoop SP70, die leiden tot het hoge percentage bescherming tegen Enterovirus 71 15 challenge. Voor de toepassing van technische referentie, onze studie maakte gebruik van de kwalitatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie om zich te concentreren op het genereren van een divalent Ad5 vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door het opnemen van een HIV-1-antigeen in HVR1 eenda Zijn tag in HVR5 van hexon5. De gegenereerde virale vector werd immunologisch onderzocht. Het antigeen capside-Incorporation strategie kan worden toegepast voor de ontwikkeling van Ad5-gevectoriseerd vaccinatie benaderingen tegen verschillende infectieziekten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) is uitgebreid gemodificeerd transgen met traditionele methoden voor vaccinontwikkeling. De verminderde efficacies deze traditioneel gemodificeerde Ad5 vectoren in klinische trials kon hoofdzakelijk worden gecorreleerd met reeds bestaande immuniteit Ad5 (PEI) onder de meerderheid van de bevolking. To-Ad5 vectored vaccin ontwikkeling te bevorderen door het oplossen van de bezorgdheid van Ad5 PEI, heeft het innovatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie toegepast. Door verdienste van deze strategie, Ad5-vectored we eerst gebouwd de hexon shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S door subkloneren het hypervariabele gebied (HVR) 1 van hexon in een eerder opgebouwd shuttle plasmide HVR5-His 6 / pH5S, die moest Zijn 6-tag opgenomen in het HVR5. Deze HVR1 DNA-fragment dat een HIV epitoop ELDKWAS gesynthetiseerd. HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S was toen lineair en co-getransformeerd met gelineariseerde backbone plasmide pAd5 / ΔH5 (GL),homologe recombinatie. Deze gerecombineerde plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-His werd getransfecteerd in cellen om de virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 genereren. Deze vector werd gevalideerd kwalitatieve conditie wordt aangegeven door virale titer fysische (VP / ml), infectieuze titer (IP / ml) en bijbehorende VP / IP ratio. Zowel de HIV-epitoop en Zijn 6-tag waren oppervlak blootgestelde op de Ad5 capside, en behield epitoopspecifieke antigeniciteit van hun eigen land. Een neutralisatietest vermeld het vermogen van deze divalente vector neutralisatie omzeilen door Ad5-positieve sera in vitro. Muizen immunisatie toonden de vorming van sterke humorale immuniteit specifiek voor het HIV epitoop en His 6. Deze studie proof-of-principle suggereerde dat het protocol in verband met het antigeen capside-Incorporation haalbare strategie kan worden toegepast voor de productie van Ad5-gevectoriseerd vaccins modificeren andere capside eiwitten. Dit protocol kan zelfs worden ferdere aangepast voor het genereren van zeldzame adenovirus serotype-gevectoriseerd vaccin.

Het antigeen capside-Incorporation strategie (figuur 1A) werd gebruikt om de tweewaardige Ad5 virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 genereren. Ten eerste, de shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S werd geconstrueerd door subklonering HVR1-KWAS fragment in de vorige geconstrueerde shuttle plasmide HVR5-His 6 / pH5S 17. Ten tweede werd het plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14 werd geconstrueerd door een homologe recombinat...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Hier presenteren we een protocol om een proof-of-principle bivalente adenovirus type 5 (Ad5) vector genereren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door gebruik te maken van de Antigen Capsid-Incorporation strategie. Deze vector werd aangetoond kwalitatieve conditie vertonen het vermogen om Ad5-positieve sera in vitro, en de antigeniteit en immunogeniteit ontsnappen naar de opgenomen antigenen.

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer&#39;s Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Detectie van Humaan leukocytenantigeen Biomarkers bij Borstkanker Gebruikmakend-Label gratis biosensortechnologie

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃƒÅ½Ã‚ÂµRI

Ontwikkeling van een<em&gt; In vitro</em&gt; Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...