Name: utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de la Santé accorde 5T32AI7493-20 et 5R01AI089337-03. Les bailleurs de fonds ne jouaient aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

L&#39;Université de l&#39;Alabama à Birmingham Comité soins en établissement et l&#39;utilisation des animaux a approuvé l&#39;utilisation de souris comme décrit ici sous le numéro 101 109 272 protocole approuvé. 1. Construction d&#39;une modification génétique plasmide PAD5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 avec la stratégie capside-Incorporation Antigène <ol><li> Construction du plasmide navette HVR1-Kwas HVR5-6-His / pH5S <ol><li> Commander un plasmide contenan...

<ol>
	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

L&#39;application de la stratégie de modification transgénique traditionnelle sur Ad5 pour le développement de vaccins a été diminué principalement en raison du goulet d&#39;étranglement associé à l&#39;Ad5 PEI 4,6. Ce goulot d&#39;étranglement peut être partiellement diminuée par application de l&#39;alternative de la stratégie Antigène capside-Incorporation (figure 1A), puisque cette stratégie peut se soustraire à la neutralisation par Ad5 NAbs en remplaçant épitopes neutr...

Adénovirus humain (Ad) est un de taille moyenne, virus non enveloppé avec une nucléocapside icosaédrique contenant une double génome d&#39;ADN simple brin. Ad appartient à la famille Adenoviridae, avec une classification en sept groupes (A à G). Chaque groupe contient le virus de différents sérotypes. Dont, adénovirus sérotype 5 (Ad5) du groupe C a été la plus étudiée et la plus largement appliquée pour les approches Vectored comme la thérapie génique et la vaccination. La stratégie transgénique traditionnelle a été développée et appliquée à des modifications Ad5, qui est caractérisé par le déplacement des gènes précoces virus avec un gène d&#39;intérêt, et l&#39;expression du gène ciblé d&#39;intérêt chez un hôte. Des exemples sont la construction de pENV9 / Ad5hrΔE3 par le remplacement du gène précoce 3 (E3) avec gène rev de virus de l&#39;immunodéficience simien 1, la construction de AdCMVGag par le remplacement du gène précoce 1 (E1) avec le gène gag de l&#39;immunodéficience humaine(VIH) 2, et la construction du lac de la pub Z en remplaçant E1 avec gène lac Z 3. La large application de la stratégie de transgène traditionnelle sur Ad5 dépend des avantages suivants: la large gamme d&#39;hôtes pour Ad5, le génie génétique réalisable sur le virus et la propagation du virus, le grand établissement de l&#39;insert de gène étranger et la sécurité de l&#39;Ad5 4,5. Cependant, les efficacités réduits de thérapies cliniques Ad5-vectorisé par l&#39;utilisation de cette stratégie a été un obstacle majeur, qui a été cartographiée à être principalement associée à Ad5 PEI, depuis Ad5 est tellement répandue parmi la majorité des enfants et des adultes 4,6. Pour surmonter le principal goulot d&#39;étranglement de l&#39;Ad5, l&#39;objectif principal est de développer une stratégie alternative contournant Ad5 PEI. L&#39;immunité innée 7, l&#39;immunité adaptative tels que des anticorps neutralisants (AcN) 10/08 T CD8 + et des réponses de lymphocytes 10 contre Ad5 a été démontré que la contribute à Ad5 PEI, avec Ad5 NAbs apparaissant à jouer un rôle dominant dans les contributions à Ad5 PEI 10,11. En outre, Ad5 NABS épitopes cibles situées dans des protéines de capside, y compris le principal hexon de protéines, de fibres et de la base du penton. Dont, hexon est la principale cible de Ad5 NAbs 8,11-13. Basé sur ces résultats, une stratégie novatrice Antigène capside-constitution a été introduite. Cette nouvelle stratégie met en évidence le remplacement ou l&#39;incorporation de protéines-de-intérêts sur Ad5 protéines de capside, qui déplace ou masque les épitopes neutralisants Ad5, conduisant à la diminution de la reconnaissance par le NAbs et efficaces administrations vecteur Ad5. Il est à noter que cette stratégie est concurrentiel car il peut aussi aider les hôtes suscitent robuste immunité humorale et l&#39;immunité cellulaire puissante en présentant directement des antigènes d&#39;intérêt pour le système immunitaire 4,14,15. Basé sur cette stratégie, le clonage moléculaire et recombinant Ad vecteur viral de sauvetage peuvent être structurellement divisésen quatre étapes principales: (a) la préparation d&#39;un fragment de gènes d&#39;intérêt soit par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) ou la synthèse; (B) la ligation du fragment de gène dans un plasmide navette qui contient le fragment génique d&#39;intérêt et les bras homologues à un squelette de l&#39;adénovirus; (C) la recombinaison homologue par co-transformation de la navette de plasmide contenant le fragment génique d&#39;intérêt avec le squelette plasmidique linéarisé PAD5 / ΔH5 (GL) 16; (D) la transfection de plasmide linéarisé adénovirus recombinant pour sauver le vecteur Ad recombinant incorporé avec des antigènes-de-intérêt. Notre groupe et quelques autres ont étendu cette stratégie alternative d&#39;incorporation de la pub pour Ad développement d&#39;un vaccin vectorisé contre différents agents pathogènes infectieux. Nous avons signalé la génération d&#39;un vecteur Ad recombinant Ad-HVR1-LGS-His 6 -V3 en incorporant un marquage His VIH-1 antigène V3 dans la locale de l&#39;Ad5 HVR1 hexon (hexon5). Ce vecteur généré str déclenchéréponse immunitaire humorale spécifique ong à l&#39;épitope V3 4. Nous avons également signalé le développement de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 en intégrant le VIH-1 membrane région ectodomaine proximale (MPER) dans les paramètres régionaux HVR2 de hexon5 2. En outre, le groupe de M. Zhou a utilisé les avantages de cette stratégie de constitution de la pub pour développer Ad sérotype 3 (Ad3) Les vaccins vectorisées, ie., La génération de vecteur viral R1SP70A3 en incorporant un SP70 épitope de neutralisation de l&#39;entérovirus 71 dans le HVR1 des Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 généré NAbs solides et la production d&#39;IFN-γ spécifiques à l&#39;épitope de SP70, qui conduisent au taux élevé de protection contre l&#39;entérovirus 71 15 défi. Aux fins de référence technique, notre étude a profité de la stratégie Antigène capside-Incorporation qualitative de se concentrer sur la génération d&#39;un vecteur Ad5 divalent Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 en incorporant un antigène du VIH-1 dans HVR1 uneda Sa balise dans HVR5 de hexon5. Le vecteur viral généré a également été évalué immunologiquement. La stratégie Antigène capside-Incorporation pourrait être utilisé pour le développement d&#39;approches de vaccination Ad5-vectorisé contre différentes maladies infectieuses.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

L&#39;adénovirus sérotype 5 (Ad5) a été largement modifié par des méthodes traditionnelles de transgène pour le développement de vaccins. Les efficacités réduites de ces vecteurs Ad5 traditionnellement modifiés dans les essais cliniques pourraient être principalement corrélées avec Ad5 immunité pré-existante (PEI) parmi la majorité de la population. Pour promouvoir le développement d&#39;un vaccin Ad5-vectorisé par la résolution de la préoccupation de l&#39;Ad5 PEI, la stratégie innovante Antigène capside-constitution a été employé. Par le mérite de cette stratégie, Ad5-guidé nous avons d&#39;abord construit la navette hexon plasmide HVR1-Kwas-HVR5-Ses 6 / pH5S par sous-clonage de la région hypervariable (HVR) 1 de hexon dans un plasmide navette construite précédemment HVR5-Ses 6 / pH5S, qui avait son étiquette 6 incorporé dans le HVR5. Ce fragment HVR1 ADN contenant un épitope ELDKWAS VIH a été synthétisé. HVR1-Kwas-HVR5-Ses 6 / pH5S était alors linéarisé et co-transformé avec le plasmide linéarisé épine dorsale PAD5 / ΔH5 (GL),pour la recombinaison homologue. Ce plasmide recombiné PAD5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His a été transfecté dans des cellules afin de générer le vecteur viral d&#39;Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Ce vecteur a été validé à avoir les aptitudes qualitative indiqué par titre virale physique (VP / ml), titre infectieux (IP / ml) et le ratio de VP correspondant / IP. Tant l&#39;épitope VIH et son étiquette 6 étaient exposés en surface sur la capside Ad5, et conservés antigénicité spécifique d&#39;épitope de leur propre. Un essai de neutralisation a indiqué la capacité de ce vecteur divalent de contourner neutralisation par des sérums positifs Ad5 in vitro. l&#39;immunisation de souris a démontré la génération de robustes immunité humorale spécifique à l&#39;épitope du VIH et son 6. Cette étude de preuve de principe a suggéré que le protocole associé à la stratégie de l&#39;antigène de capside-incorporation pourrait être faisable utilisé pour la génération de vaccins à vecteur Ad5 en modifiant différentes protéines de capside. Ce protocole pourrait même être Futres modifié pour la production de vaccins à vecteur d&#39;adenovirus de serotype rare.

La stratégie Antigène capside-Incorporation (figure 1A) a été utilisé pour générer le bivalent Ad5 vecteur viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Tout d&#39;abord, le plasmide navette HVR1-Kwas HVR5-6-His / pH5S a été construit en sous-clonant le fragment HVR1-Kwas dans le plasmide navette de construction précédente HVR5-His 6/17 pH5S. En second lieu, le plasmide PAD5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His 14 a été construit par une recombi...

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Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Ici, nous présentons un protocole pour générer un type bivalent adénovirus 5 (Ad5) vecteur preuve-de-principe Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 en utilisant la stratégie Antigène capside-Incorporation. Ce vecteur a été démontrée à exposer remise en forme qualitative, la capacité d&#39;échapper sérums Ad5 positif in vitro, et l&#39;antigénicité ainsi que l&#39;immunogénicité des antigènes incorporés.

Utilisant la stratégie capside-Incorporation Antigen pour le développement d&#39;approches adénovirus sérotype 5 Vectored vaccins

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

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