Name: utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise durch National Institutes of Health gewährt 5T32AI7493-20 und 5R01AI089337-03 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Die Universität von Alabama in Birmingham Institutional Animal Benutzung und Pflege Committee genehmigt die Verwendung von Mäusen, wie sie hier im Rahmen der genehmigten Protokoll-Nummer 101109272 beschrieben. 1. Genetische Konstruktion eines modifizierten Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie <ol><li> Der Bau des Shuttle-Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S <ol><li> Bestellen ein Plasmid, das die synthetisierte DNA Seq...

<ol>
	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

Die Anwendung des traditionellen Transgen Strategie Ad5 Modifikation für die Entwicklung von Impfstoffen wurde in erster Linie auf den Flaschenhals mit der Ad5 PEI 4,6 zugeordnet vermindert worden. Dieser Engpass kann teilweise durch Anwendung der alternativen Antigen Capsid-Incorporation Strategie (Abbildung 1A) vermindert werden, da diese Strategie kann die Neutralisation von Ad5 NAbs entziehen indem neutralisierende Epitope von Ad5 mit Antigenen von Interesse, und erleichtert die Erzeugun...

Humanen Adenovirus (Ad) ist eine mittelgroße, nicht umhüllte Virus mit einem ikosaedrischen Nukleokapsid, das eine doppelsträngige DNA-Genom. Anzeige gehört zu der Familie Adenoviridae, mit einer Einteilung in sieben Gruppen (A bis G). Jede Gruppe enthält Virus der verschiedenen Serotypen. Von denen, Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) aus der Gruppe C war der am besten untersuchten und die am meisten für vectored Ansätze wie die Gentherapie und Impfungen angewendet. Die traditionelle Strategie Transgen wurde entwickelt und für Ad5 Modifikationen, die durch die Verschiebung der Virus-Early-Gene mit einem Gen von Interesse charakterisiert ist, und der fokussierte Expression des Gens von Interesse in einem Wirt. Beispiele sind der Bau von pENV9 / Ad5hrΔE3 durch Ersetzen des frühen Gens 3 (E3) mit rev-Gen des Simian Immunodeficiency Virus 1, die Konstruktion AdCMVGag durch Ersetzen des frühen Gens 1 (E1) mit dem gag-Gen des Human ImmunodeficiencyVirus (HIV) 2, und der Aufbau der Anzeige lac Z durch Ersetzen E1 mit lac Z-Gen 3. Die breite Anwendung der traditionellen transgene Strategie für Ad5 hängt von folgenden Vorteile: die Vielzahl von Hosts für Ad5, die machbar Gentechnik auf Viren und Virusvermehrung, die große Aufnahme von Fremdgens Einsatz und die Sicherheit von Ad5 4,5. Allerdings sind die reduzierten Wirkungsgrade Ad5-vektor klinischen Therapien durch die Verwendung dieser Strategie war ein wichtiger Engpass, der kartiert hat in erster Linie mit Ad5 PEI zugeordnet werden, da Ad5 ist so weit verbreitet bei der Mehrheit der Kinder und Erwachsene 4,6. Um den Engpass von Ad5 zu überwinden, ist das vorrangige Ziel, eine alternative Strategie Umgehung Ad5 PEI zu entwickeln. Angeborenen Immunität 7 adaptiven Immunität wie neutralisierende Antikörper (NAbs) 8-10 und CD8 + T-Zellantworten gegen 10 Ad5 wurde gezeigt, zusammenntribute zu Ad5 PEI mit Ad5 NAbs erscheinen, um die dominante Rolle bei den Beiträgen um Ad5 PEI 10,11 zu spielen. Außerdem Ad5 NABS Zielepitope in Kapsidproteine ​​gelegen, darunter die Hauptprotein Hexon, Ballaststoffe und Pentonbasis. Davon ist Hexon das Hauptziel von Ad5 NAbs 8,11-13. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine innovative Antigen Capsid-Incorporation Strategie eingeführt. Diese neue Strategie hebt die Ersatz oder Einbau von Proteinen von Interesse auf Ad5 Kapsid-Proteine, welche die Ad5 neutralisierende Epitope verschiebt oder Masken, die zur Anerkennung durch die verringerte NAbs und effiziente Ad5 Vektor Verwaltungen. Es ist bemerkenswert, dass diese Strategie ist wettbewerbsfähig, weil es kann auch helfen, Hosts zu entlocken robuste humorale Immunität und starke zelluläre Immunität durch direkte Präsentation von Antigenen von Interesse für das Immunsystem 4,14,15. Auf der Basis dieser Strategie kann die molekulare Klonierung und rekombinante virale Vektor Ad Rettungsstrukturteilenin vier Schritten: (a) die Herstellung von Gen-of-Interest-Fragment entweder durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder der Synthese; (B) die Ligation des Genfragments in einem Shuttle-Plasmid, das das Gen von Interesse homologe Fragment und Arme an einen Adenovirus-Rückgrat enthält; (C) eine homologe Rekombination durch Co-Transformation mit dem Shuttle-Plasmid, das das Gen von Interesse Fragment mit dem linearisierten Plasmid-Rückgrat pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) die Transfektion linearisiert rekombinanten adenoviralen Plasmid zu retten, die das rekombinante Ad-Vektor mit Antigenen von Interesse aufgenommen. Unsere Gruppe und einige andere haben dieses alternative Ad Einarbeitung Strategie für Ad vectored Entwicklung von Impfstoffen gegen verschiedene Infektionserreger erweitert. Wir berichteten die Erzeugung eines rekombinanten Vektors Ad Ad-HVR1-Lgs-His 6 -V3 durch Einbringen eines His-HIV-1-Antigen V3 in die HVR1 Gebietsschema der Ad5 Hexon (hexon5). Dies erzeugt vector ausgelöst strOng humoralen Immunantwort spezifisch für die V3-Epitop 4. Wir berichteten auch die Entwicklung von Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 indem HIV-1-Membran proximalen Ektodomäne Bereich (MPER) in die HVR2 locale hexon5 2. Darüber hinaus hat Dr. Zhous Gruppe die Vorteile dieser Ad Einbau-Strategie verwendet, um Ad-Serotyp 3 (Ad3) vektorisierte Impfstoffe, dh. Die Entwicklung, die Erzeugung von viralen Vektor R1SP70A3 durch den Einbau eines neutralisierende Epitop SP70 von Enterovirus 71 in den HVR1 der Ad3 Hexon (hexon3). R1SP70A3 erzeugt starke NAbs und IFN-γ Produktion spezifisch für das Epitop SP70, die auf die hohe Rate der Schutz gegen Enterovirus 71 Herausforderung 15 führen. Zum Zwecke der technischen Referenz, nahmen unsere Studie Vorteil der qualitativen Antigen Capsid-Incorporation Strategie, sich auf die Erzeugung eines zweiwertigen Ad5 Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 konzentrieren indem ein HIV-1-Antigen in HVR1 einda His-Tag in der HVR5 hexon5. Die erzeugte Virusvektor wurde ebenfalls immunologisch bewertet. Das Antigen Capsid-Incorporation Strategie könnte auf die Entwicklung von Ad5-vektor Impfung Ansätze gegen verschiedene Infektionskrankheiten eingesetzt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) wurde ausgiebig mit traditionellen Transgen Methoden zur Impfstoffentwicklung modifiziert. Die reduzierten Wirkungsgrade dieser traditionell geändert Ad5-Vektoren in klinischen Studien konnte in erster Linie mit Ad5 vorbestehenden Immunität (PEI) bei der Mehrheit der Bevölkerung korreliert werden. Um Ad5-vektorImpfstoffEntwicklung durch die Lösung der Anliegen der Ad5 PEI fördern, hat die innovative Antigen Capsid-Incorporation Strategie verwendet worden. Von Vorteil dieser Strategie Ad5 vektor wir zunächst die Hexon Shuttle konstruierte Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S durch Subklonieren der hypervariablen Region (HVR) 1 von Hexon in einen zuvor aufgebauten Shuttle-Plasmid HVR5-His 6 / pH5S, das hatte seine 6-Tag in die HVR5 eingebaut. Diese HVR1 DNA Fragment, das ein HIV-Epitop ELDKWAS synthetisiert. HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S war dann linearisiert und co-transformiert mit linearisierter Plasmid-Rückgrat pAd5 / ΔH5 (GL),zur homologen Rekombination. Diese kombinierte Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 wurde in Zellen transfiziert, um erzeugen den viralen Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Dieser Vektor wurde validiert, um qualitative Eignung durch virale Titer physikalischen (VP / ml) angegeben, infektiöse Titer (IP / ml) und entsprechende VP / IP-Verhältnis haben. Sowohl die HIV-Epitop und His 6 -Tag waren oberflächenexponierten auf der Ad5 Kapsid, und behielt Epitop-spezifischen Antigenität ihrer eigenen. Ein Neutralisationstest zeigte die Fähigkeit dieser zweiwertigen Vektor Neutralisierung durch Ad5-positiven Seren in vitro zu umgehen. Mice Immunisierung zeigten die Erzeugung von robuster humorale Immunität spezifisch für die HIV-Epitop und His 6. Diese Proof-of-Principle-Studie vorgeschlagen, dass das Protokoll mit dem Antigen Capsid-Incorporation Strategie assoziiert könnten durchaus für die Erzeugung von Ad5-vektor Impfstoffe durch Modifikation verschiedener Kapsidproteine ​​genutzt werden. Dieses Protokoll kann auch feiter zur Erzeugung von Seltenen Serotyp adenoviralen Impfstoffe modifiziert.

Das Antigen Capsid-Incorporation Strategie (Abbildung 1A) wurde eingesetzt, um das zweiwertige Ad5 virale Vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 zu erzeugen. Zunächst wird das Shuttle-Plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S wurde durch Subklonieren HVR1-KWAS Fragment in den früheren Shuttle-Plasmid konstruiert HVR5-His 6 / pH5S 17 aufgebaut. Zweitens das Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14 wurde durch eine homologe Rekombination zwische...

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Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

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