Name: utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקה 5T32AI7493-20 ו5R01AI089337-03. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם בבעלי חיים מוסדי שימוש וטיפול הוועדה אישרה את השימוש בעכברים כמתואר במסמך זה תחת מספר הפרוטוקול שאושר על 101,109,272. 1. גנטי בנייה השתנה פלסמיד pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 עם capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen <ol st...

<ol>
	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

היישום של אסטרטגית transgene המסורתית על שינוי Ad5 לפיתוח של חיסונים כבר פחת בעיקר בשל צוואר הבקבוק הקשורים לAd5 PEI 4,6. צוואר בקבוק זה יכול להצטמצם באופן חלקי על ידי יישום של האסטרטגיה החלופית Antigen capsid על-התאגדות (איור 1 א), שכן אסטרטגיה זו יכולה להתחמק נטרול על י...

אדנווירוס אדם (מודעות) הוא וירוס עם nucleocapsid icosahedral מכיל הגנום DNA גדילים כפול בגודל בינוני, שאינו-עטף. מודעות שייכת למשפחת adenoviridae, עם סיווג לשבע קבוצות (עד G). כל קבוצה מכילה וירוס של סרוטיפים שונים. מזה, אדנווירוס סרוטיפ 5 (Ad5) מהקבוצה C כבר בהרחבה הנחקרת ביותר ומיושמים באופן נרחב ביותר לגישות וקטורים כמו ריפוי גנטי וחיסונים. אסטרטגית transgene המסורתית פותחה ומיושמת לשינויים Ad5, המתאפיין בתזוזה של גנים המוקדמים הווירוס עם גן-של-עניין, והביטוי הממוקד של הגן-של-עניין במארח. דוגמאות לכך הן הבנייה של pENV9 / Ad5hrΔE3 ידי החלפת גנים מוקדמים 3 (E3) עם גן rev של קופי וירוס כשל חיסוני 1, בניית AdCMVGag ידי החלפת גנים מוקדמים 1 (E1) עם גן איסור הפרסום של כשל חיסוני אנושיוירוס (HIV) 2, והבנייה של Z לאק מודעות על ידי החלפת E1 עם גן Z אק 3. היישום הרחב של אסטרטגית transgene המסורתית על Ad5 תלוי בגוף הבא: מגוון הרחב של מארחים לAd5, ההנדסה הגנטית אפשרית בנגיף והתפשטות וירוס, האירוח הגדול של הכנס גן זר והבטיחות של Ad5 4,5. עם זאת, efficacies המופחת של טיפולים קליניים וקטורים-Ad5 על ידי שימוש באסטרטגיה זו היה צוואר בקבוק עיקרי, אשר מופה להיות קשורות בעיקר עם Ad5 PEI, מאז Ad5 היא כל כך נפוץ בקרב רוב הילדים ומבוגרים 4,6. כדי להתגבר על צוואר הבקבוק העיקרי של Ad5, המטרה העיקרית היא לפתח אסטרטגיה חלופית עקיפת Ad5 PEI. חסינות מולדת 7, חסינות אדפטיבית כגון נוגדנים מנטרלים תגובות תא (nabs) 8-10 וCD8 + T 10 נגד Ad5 הוכחו שיתוףntribute לAd5 PEI, עם Ad5 nabs מופיע לשחק את התפקיד הדומיננטי בתרומות לAd5 PEI 10,11. יתר על כן, Ad5 nabs epitopes היעד ממוקמת בחלבוני קפסיד, כולל hexon העיקרי החלבון, סיבים ובסיס פנטון. מזה, hexon הוא היעד העיקרי של Ad5 nabs 8,11-13. בהתבסס על ממצאים אלה, אסטרטגית Antigen capsid על-התאגדות חדשנית כבר הציגה. אסטרטגית רומן זה מדגישה את ההחלפה או שילוב של חלבונים של ריבית על חלבוני קפסיד Ad5, שעוברים או מסכות epitopes Ad5 נטרול, שמובילה להכרה ירד ב nabs וממשלי וקטור Ad5 יעילים. ראוי לציין כי אסטרטגיה זו היא תחרותית כי זה גם יכול לעזור מארחים לעורר חסינות הלחות חזקה וחסינות תאית חזקה ישירות על ידי הצגת אנטיגנים של עניין למערכת החיסונית 4,14,15. בהתבסס על אסטרטגיה זו, השיבוט המולקולרי והצלת וקטור נגיפי מודעות רקומביננטי ניתן לחלק מבנילארבעה שלבים עיקריים: (א) הכנת בר הגן-של-עניין מתגובה או שרשרת פולימרז (PCR) או סינתזה; (ב) קשירה של בר הגן לפלסמיד הסעות המכיל את קטע הגן-של-עניין וזרועות הומולוגיות לשדרת אדנווירוס; רקומבינציה ההומולוגית על ידי (ג) פלסמיד ההסעות המכיל בר הגן-של-עניין עם פלסמיד עמוד השדרה לינארית pAd5 / ΔH5 (GL) 16 הפיכת שותף; (ד) transfection של פלסמיד adenoviral רקומביננטי לינארית כדי להציל את וקטור מודעות רקומביננטי משולב עם אנטיגנים של עניין. הקבוצה ועוד כמה שלנו הרחיבו את האסטרטגיה זו חלופת מודעות התאגדות לפיתוח חיסון וקטורי מודעות נגד פתוגנים זיהומיות שונים. דיווחנו הדור של וקטור רקומביננטי מודעת מודעה-HVR1-LGS-6 -V3 על ידי שילוב אנטיגן HIV-1 מתויג V3 לאזור HVR1 של hexon Ad5 (hexon5). וקטור שנוצר זה מופעל על strתגובת אונג הלחות חיסון ספציפית לאפיטופ V3 4. אנחנו גם דיווחו על ההתפתחות של Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 על ידי שילוב אזור HIV-1 קרום ectodomain הפרוקסימלי (MPER) לאזור HVR2 של hexon5 2. בנוסף, קבוצתו של ד&quot;ר ג &#39;והשתמשה ביתרונות של אסטרטגית התאגדות מודעות זו לפתח מודעות סרוטיפ 3 (Ad3) חיסוני וקטורים, כלומר., הדור של R1SP70A3 וקטור הנגיפי על ידי שילוב SP70 epitope נטרול של Enterovirus 71 לHVR1 של Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 נוצר nabs חזק וייצור IFN-γ הספציפי לSP70 epitope, שיוביל לשיעור הגבוה של הגנה מפני Enterovirus 71 אתגר 15. לצורך ההתייחסות הטכנית, המחקר שלנו ניצל את אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות האיכותית להתמקד בדור של וקטור Ad5 דו ערכי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי שילוב אנטיגן HIV-1 לHVR1דה תגו לHVR5 של hexon5. הווקטור הנגיפי שנוצר היה גם הערכת מערכת חיסון. אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות יכולה להיות מנוצלת לפיתוח גישות חיסון וקטורים-Ad5 נגד מחלות זיהומיות שונות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

סרוטיפ אדנווירוס 5 (Ad5) השתנה באופן נרחב בשיטות מסורתיות transgene לפיתוח החיסון. Efficacies המופחת של וקטורי Ad5 שונה באופן מסורתי אלה בניסויים קליניים יכול להיות מתואם בעיקר עם חסינות Ad5 קיימים מראש (PEI) בקרב רוב האוכלוסייה. כדי לקדם את פיתוח חיסון-וקטורי Ad5 על ידי פתרון הדאגה של Ad5 PEI, אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות החדשנית כבר מועסק. על ידי הכשרון של אסטרטגיה זו, Ad5-וקטורים שנבנינו מעבורת hexon ראשונה פלסמיד HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S ידי subcloning אזור hypervariable (HVR) 1 של hexon לפלסמיד הסעות נבנה בעבר HVR5-6 / pH5S, שהיה לו תג 6 שולב HVR5. בר זה HVR1 DNA המכיל HIV epitope ELDKWAS היה מסונתז. HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S היה אז לינארית ושיתוף הפך עם pAd5 פלסמיד עמוד השדרה לינארית / ΔH5 (GL),לרקומבינציה ההומולוגית. פלסמיד recombined זה pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 היה transfected לתאים לייצר הווקטור הנגיפי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. וקטור זו קיבל תוקף יש כושר איכותי שצוין על ידי כייל פיזי (סמנכ&quot;ל / מיליליטר) נגיפי, כייל זיהומיות (IP / מיליליטר) וסמנכ&quot;ל יחס / IP מתאים. שני epitope HIV והתג 6 שלו היו בקפסיד Ad5 משטח חשוף, ושמר על antigenicity epitope הספציפי משלהם. Assay נטרול הצביע על היכולת של וקטור דו ערכי זה לעקוף נטרול על ידי סרה Ad5 חיובית במבחנה. חיסון עכברים הוכיח את הדור של ספציפי חסינות הלחות החזקה לאפיטופ HIV ו -6. מחקר ההוכחה של עיקרון זה הציע כי הפרוטוקול הקשורים לאסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות יכול להיות מנוצל יתכן עבור הדור של חיסוני וקטורים-Ad5 ידי שינוי חלבוני קפסיד שונים. פרוטוקול זה יכול אפילו להיות further שונה עבור הדור של חיסונים-וקטורי אדנווירוס נדיר-סרוטיפ.

אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות (איור 1 א) נוצלה ליצירה דו הערכי הווקטור הנגיפי Ad5 Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. ראשית, הסעות פלסמיד HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S נבנה על ידי subcloning בר HVR1-קוואס לפלסמיד ההסעות נבנו הקודם HVR5-6 / pH5S 17. שנית, pAd5 פלסמיד / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6</su...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור וקטור הוכחה של עיקרון סוג אדנווירוס דו הערכי 5 (Ad5) Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי ניצול אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. וקטור זה הודגם להפגין כושר איכותי, היכולת להימלט סרה Ad5 חיובית במבחנה, וantigenicity כמו גם חיסונית לאנטיגנים המשולבים.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

איתור של יקוציט האדם Antigen Biomarkers בסרטן שד ניצול הטכנולוגיה biosensor ללא תווית

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃƒÅ½Ã‚ÂµRI

פיתוח<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת מודל לחקר האינטראקציה של<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...