Name: utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health concede 5T32AI7493-20 e 5R01AI089337-03. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

L&#39;Università di Alabama a Birmingham Istituzionale uso di animali e Comitato Cura ha approvato l&#39;uso di topi, come descritto qui sotto il numero di protocollo approvato 101.109.272. 1. genetica Costruzione di un plasmide modificato pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 con la strategia Antigen Capside-Incorporation <ol><li> Costruzione del plasmide shuttle HVR1-Kwas-HVR5-I suoi 6 / pH5S <ol><li> Ordina un plasmide contenente la sequenza di DNA sintetizzato HVR1-Kwas...

<ol>
	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

L&#39;applicazione della strategia transgene tradizionale sulla modificazione Ad5 per lo sviluppo di vaccini è stata diminuita principalmente per il collo di bottiglia associato alla Ad5 PEI 4,6. Questo collo di bottiglia può essere parzialmente diminuito applicando il alternativa strategia capside-Incorporation (Figura 1A), poiché questa strategia può sfuggire neutralizzazione da Ad5 NAbs sostituendo neutralizzanti epitopi di Ad5 con antigeni-di interesse, e facilitare la generazione di ...

Adenovirus umano (Ad) è un virus senza involucro di medie dimensioni con un nucleocapside icosaedrica con un letto genoma DNA filamento. Ad appartiene alla famiglia Adenoviridae, con una classificazione in sette gruppi (da A a G). Ciascun gruppo contiene virus di diversi sierotipi. Di cui, adenovirus sierotipo 5 (Ad5) dal gruppo C è stato il più ampiamente studiato e il più ampiamente richiesto approcci Vectored come la terapia genica e le vaccinazioni. La strategia transgene tradizionale è stato sviluppato e applicato per modifiche Ad5, che si caratterizza per lo spostamento dei primi virus geni con un gene di interesse, e l&#39;espressione mirata del gene di interesse in un host. Esempi sono la costruzione di pENV9 / Ad5hrΔE3 sostituendo presto gene 3 (E3) con rev gene di Simian Immunodeficiency Virus 1, la costruzione di AdCMVGag sostituendo presto gene 1 (E1) con il gene gag di immunodeficienza umanaVirus (HIV) 2, e la costruzione di Ad lac Z sostituendo E1 con gene lac Z 3. L&#39;ampia applicazione della strategia transgene tradizionale Ad5 dipende dai seguenti vantaggi: l&#39;ampia gamma di ospiti per Ad5, dell&#39;ingegneria gene fattibile su virus e la propagazione del virus, la grande alloggio dell&#39;inserto gene estraneo e la sicurezza di Ad5 4,5. Tuttavia, i valori di efficacia ridotto di terapie cliniche Ad5-vettorizzate mediante l&#39;uso di questa strategia è stato un collo di bottiglia importante, che è stato mappato per essere associato principalmente Ad5 PEI, dato che Ad5 è così diffuso tra la maggior parte dei bambini e degli adulti 4,6. Per superare il principale collo di bottiglia Ad5, l&#39;obiettivo primario è quello di sviluppare una strategia alternativa aggirare Ad5 PEI. L&#39;immunità innata 7, immunità adattativa come anticorpi neutralizzanti (NABS) 8-10 e CD8 + T risposte delle cellule 10 contro Ad5 hanno dimostrato di collaborarentribute a Ad5 PEI, con Ad5 NAbs che sembra svolgere il ruolo dominante dei contributi per Ad5 PEI 10,11. Inoltre, Ad5 NAB epitopi beneficiarie situate in proteine ​​del capside, tra cui la principale hexon proteine, fibre e base Penton. Di cui, hexon è l&#39;obiettivo principale di Ad5 NAbs 8,11-13. Sulla base di questi risultati, è stato introdotto un innovativo strategia Antigen Capside-incorporazione. Questo romanzo strategia mette in evidenza la sostituzione o integrazione di proteine-di-interessi su proteine ​​del capside Ad5, che sposta o maschere epitopi Ad5 neutralizzanti, che porta alla diminuzione riconoscimento da parte NAbs ed efficienti le amministrazioni vettoriali Ad5. È interessante notare che questa strategia è competitivo, perché può anche aiutare gli host suscitano robusta immunità umorale e dell&#39;immunità cellulare potente da direttamente presentando antigeni di interessi per il sistema immunitario 4,14,15. Sulla base di questa strategia, la clonazione molecolare e ricombinante salvataggio annuncio vettore virale può essere strutturalmente divisoin quattro fasi principali: (a) la preparazione di frammento di gene di interessi da una reazione a catena della polimerasi (PCR) o sintesi; (B) la legatura del frammento di gene in un plasmide navetta che contiene il frammento di gene-di-interesse e braccia omologhe a una backbone adenovirus; (C) la ricombinazione omologa da co-trasformando il plasmide shuttle contenente il frammento di gene di interessi con la spina dorsale plasmide linearizzato pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) la transfezione di linearizzato plasmide adenovirale ricombinante per salvare il vettore ricombinante annuncio integrato con gli antigeni-di-interessi. Il nostro gruppo e alcuni altri hanno esteso questa strategia incorporazione Annuncio alternativa per annuncio lo sviluppo di vaccini vectored contro diversi agenti patogeni infettivi. Abbiamo riportato la generazione di un annuncio vettore ricombinante Ad-HVR1-lgs-His 6 -v3 incorporando un His-tag HIV-1 antigene V3 nel locale HVR1 di Ad5 hexon (hexon5). Questo vettore generato innescato strong risposta immunitaria umorale specifica per il epitopo V3 4. Abbiamo anche segnalato lo sviluppo di Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 incorporando HIV-1 membrana regione ectodomain prossimale (MPER) nel locale HVR2 di hexon5 2. Inoltre, il gruppo del Dr. Zhou ha utilizzato i benefici di questa strategia Ad integrazione di sviluppare annuncio sierotipo 3 (Ad3) vaccini vettorizzate, vale a dire., La generazione di virus vettore R1SP70A3 incorporando un SP70 neutralizzante epitopo di Enterovirus 71 nella HVR1 di Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 generato NAbs forti e produzione di IFN-γ specifici per la SP70 epitopo, che portano al alto tasso di protezione contro Enterovirus 71 sfida 15. Ai fini di riferimento tecnico, il nostro studio ha approfittato della strategia qualitativa Antigen Capside-incorporazione di concentrarsi sulla generazione di un bivalente Ad5 vettore Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 incorporando un antigene HIV-1 in HVR1 unda sua tag nel HVR5 di hexon5. Il vettore virale generato è stato anche immunologicamente valutata. La strategia di Antigen Capside-Incorporation potrebbero essere utilizzati per lo sviluppo di approcci di vaccinazione Ad5-vettorizzate contro diverse malattie infettive.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

Adenovirus sierotipo 5 (Ad5) è stato ampiamente modificato con metodi tradizionali transgene per lo sviluppo di vaccini. Le efficacies ridotte di questi vettori Ad5 tradizionalmente modificati negli studi clinici potrebbero essere correlati principalmente Ad5 immunità pre-esistente (PEI) tra la maggioranza della popolazione. Per promuovere lo sviluppo di vaccini Ad5 vettorizzate risolvendo la preoccupazione di Ad5 PEI, l&#39;innovativa strategia di Antigen Capside-Incorporation è stato impiegato. Per merito di questa strategia, Ad5 vettorizzate abbiamo costruito la navetta hexon plasmide HVR1-Kwas-HVR5-I suoi 6 / pH5S di subcloning regione ipervariabile (HVR) 1 di hexon in un plasmide shuttle precedentemente costruito HVR5-I suoi 6 / pH5S, che ha avuto il suo tag 6 incorporato nel HVR5. Questo frammento di DNA che contiene una HVR1 HIV epitopo ELDKWAS è stato sintetizzato. HVR1-Kwas-HVR5-I suoi 6 / pH5S era allora linearizzato e co-trasformato con linearizzato dorsale plasmide pAd5 / ΔH5 (GL),per ricombinazione omologa. Questo plasmide ricombinato pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 è stato trasfettato in cellule per generare il vettore virale Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Questo vettore è stato validato per avere idoneità qualitativa indicato dal titolo virale fisico (VP / ml), titolo infettiva (IP / ml) e corrispondenti il ​​rapporto / IP VP. Sia l&#39;epitopo HIV e la sua etichetta 6 erano-superficie esposta sul capside Ad5, e trattenuti specifici epitopi antigenicità di loro. Un saggio di neutralizzazione indicava la capacità di questo bivalente vettore per aggirare la neutralizzazione da sieri Ad5 positivi in vitro. I topi di immunizzazione ha dimostrato la generazione di robusta immunità umorale specifica per l&#39;epitopo HIV e la sua 6. Questo studio di prova di principio suggerito che il protocollo associato alla strategia capside-Incorporation potrebbe essere fattivamente utilizzato per la generazione di vaccini Ad5-vettorizzate modificando diverse proteine ​​del capside. Questo protocollo potrebbe anche essere fn ulteriore modificato per la generazione di rare sierotipo vaccini adenovirus vettorizzate.

La strategia di Antigen Capside-Incorporation (Figura 1A) è stato utilizzato per generare il bivalente Ad5 vettore virale Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. In primo luogo, la navetta plasmide HVR1-Kwas-HVR5-Il suo 6 / pH5S è stato costruito da subcloning HVR1-Kwas frammento nella precedente plasmide shuttle costruito HVR5-Il suo 6 / pH5S 17. In secondo luogo, il plasmide pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14 è stato costruito da una ricombina...

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Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare una prova di principio di tipo bivalente adenovirus 5 (Ad5) vettore Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 utilizzando la strategia di Antigen Capside-incorporazione. Questo vettore è stato dimostrato per esporre idoneità qualitativa, la capacità di sfuggire sieri Ad5-positivi in vitro, e l&#39;antigenicità e immunogenicità agli antigeni incorporati.

Utilizzando la strategia di Antigen Capside-Incorporation per lo sviluppo di approcci Adenovirus sierotipo 5 Vectored vaccino

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

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