Name: utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00
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この作品は、国立衛生研究所5T32AI7493-20と5R01AI089337-03を付与することによって部分的にサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備で何の役割も持っていません。

承認されたプロトコル番号101109272の下で本明細書に記載されるようバーミンガム動物実験を使用してケア委員会でのアラバマ大学は、マウスの使用を承認しました。 1.遺伝的構築改変プラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6抗原キャプシド取り込み戦略と<ol><li>シャトルプラスミドの構築HVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5S <ol><li> hexon5遺伝子ののAccIに制限酵素サイトのAgeI?...

<ol>
	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

ワクチンの開発のためのAd5変更の伝統的な導入遺伝子戦略の適用は主に、Ad5のPEI 4,6に関連するボトルネックに減少されました。この戦略は、抗原の関心とのAd5の中和エピトープを交換したAd5のNABによる中和を回避し、強固な免疫の発生を促進することができるので、このボトルネックは、部分的に、代替的な抗原キャプシド組み込み戦略（ 図1A）を適用することによっ?...

ヒトアデノウイルス（AD）は、二本鎖DNAゲノムを含む正二十面体ヌクレオカプシドと中型、非エンベロープウイルスです。広告は、7つのグループに分類（Gを介してA）と、アデノウイルスファミリーに属します。各グループは、異なる血清型のウイルスが含まれています。これは、グループCは最も広範に研究され、最も広く、遺伝子治療や予防接種などのベクトル化手法に適用されてきたから、アデノウイルス血清型5（Ad5の）の。 伝統的な導入遺伝子の戦略が開発され、目的遺伝子を有するウイルス初期遺伝子の変位することを特徴とするAd5の修正のために適用され、目的遺伝子の宿主中での集表現されています。例としては、サル免疫不全ウイルス1のrev遺伝子と初期遺伝子3（E3）を置き換えることによってpENV9 /Ad5hrΔE3の構築であり、ヒト免疫不全のgag遺伝子と初期遺伝子1（E1）を置き換えることによりAdCMVGagの建設ウイルス（HIV）2、およびlac Z遺伝子の 3でE1を置き換えることによって広告のlac Zの構築。 Ad5の上の伝統的な導入遺伝子戦略の広範なアプリケーションは、次のメリットに依存しますのAd5、ウイルスおよびウイルス増殖の実現可能な遺伝子工学、外来遺伝子挿入物の大規模な宿泊施設とのAd5 4,5の安全のためにホストの広い範囲。しかし、この戦略を使用してAd5のベクトル化臨床治療の有効性を減少させたがAd5のは、子供と大人4,6の大部分の間でとても普及しているので、主に、Ad5のPEIと関連していることがマッピングされている主要なボトルネック、となっています。 Ad5のの主要なボトルネックを克服するために、主な目的は、Ad5のPEIを回避代替戦略を開発することです。このような中和抗体（NABS）8-10およびCD8 + T細胞応答などの自然免疫7、適応免疫は、Ad5のに対して、10が共同することが示されていますAd5のNABSはAd5のPEI 10,11に貢献で支配的な役割を果たしているように見えると、Ad5のPEIにntribute。また、Ad5のは、主要なタンパク質、ヘキソン、ファイバーおよびペントンベースなどのキャプシドタンパク質に位置する標的エ​​ピトープを、NABS。このうち、ヘキソンはAd5のNABS 8,11-13の主要な標的です。これらの知見に基づいて、革新的な抗原キャプシド取り込み戦略が導入されています。この新規戦略はNABSかつ効率的なのAd5ベクター投与により減少した認識をもたらす、タンパク質の関心のAd5中和エピトープをシフトさせるか、マスクのAd5キャプシドタンパク質、上の交換または取り込みを強調しています。それはまた、ホストが強固な体液性免疫と直接免疫系4,14,15に抗原の関心を提示することによって、強力な細胞性免疫を誘発することができますので、この戦略は競争力があることは注目に値します。この戦略に基づき、分子クローニングおよび組換え広告ウイルスベクターのレスキューは、構造的に分割することができます4つの主要なステップには、（a）いずれかのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または合成により目的遺伝子断片を調製します。 （b）は、アデノウイルス骨格に目的遺伝子断片との相同アームを含んでいるシャトルプラスミドへの遺伝子断片の連結を、 （C）線形化バックボーンプラスミドPAD5 /ΔH5（GL）16で目的遺伝子断片を含むシャトルプラスミドを同時形質転換することにより、相同組換え、 （d）の線状化組換えアデノウイルスプラスミドのトランスフェクションは、抗原の関心を組み込んだ組換えAdベクターを救出します。 私たちのグループと他のいくつかは、別の感染性病原体に対する広告ベクターワクチン開発のためのこの代替広告の取り込み戦略を高めています。我々は、組換えAdベクターの生成を報告したAd-HVR1-LGS-彼のAd5ヘキソン（hexon5）のHVR1ロケールにHis標識HIV-1抗原V3を組み込むことにより、6 -V3。この生成されたベクターは、STRをトリガV3エピトープ4に固有オング液性免疫応答。また、hexon5 2のHVR2ロケールにHIV-1膜近位外部ドメイン領域（MPER）を組み込むことによって、Ad5の/ HVR2-MPER-L15ΔE1の開発を報告しました。また、博士周のグループは、Ad血清型3（のAd3）ベクトル化ワクチンを、 すなわち 。開発するために、この広告の取り込み戦略の利点を使用していた、のAd3のHVR1にエンテロウイルス71の中和エピトープSP70を組み込むことにより、ウイルスベクターR1SP70A3の生成ヘキソン（hexon3）。 R1SP70A3はエンテロウイルス71チャレンジ15に対する保護の高い率につながる強いNABSおよびエピトープSP70に特異的IFN-γ産生を、生成されました。 テクニカルリファレンスの目的のために、私たちの研究では、HVR1に、HIV-1抗原を組み込むことによって、二価のAd5ベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6の生成に焦点を当てる定性的な抗原キャプシド取り込み戦略を利用しましたANダhexon5のHVR5にHisタグ。生成されたウイルスベクターはまた、免疫学的に評価しました。抗原キャプシド取り込み戦略は異なる感染症に対するAd5のベクトル化ワクチン接種アプローチの開発に向けて利用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

アデノウイルス血清型5（Ad5の）が広くワクチン開発のための従来の方法を用いて導入遺伝子改変されています。臨床試験においてこれらの伝統的改変Ad5ベクターの減少効力は主として人口の大部分の間でのAd5既存の免疫（PEI）と相関させることができました。 Ad5のPEIの懸念を解決することによってのAd5-ベクターワクチンの開発を促進するために、革新的な抗原キャプシド取り込み戦略が採用されています。この戦略のメリットにより、Ad5のベクトル化は、まず以前に構築シャトルプラスミドHVR5-彼6 / pH5Sに超可変領域（HVR）ヘキソンの1をサブクローニングすることにより、ヘキソンシャトルプラスミドHVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sを構築し、これHVR5に組み込む彼の6タグを持っていました。 HIVエピトープELDKWASを含むHVR1このDNA断片を合成しました。 HVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sその後、線形化したと、線形化骨格プラスミドPAD5 /ΔH5（GL）で同時形質転換します相同組換えのため。この組み換えプラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5は、彼の6は、ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6を生成するために、細胞にトランスフェクトしました。このベクターは、ウイルスの物理的力価（VP / mlで）によって示される定性的なフィットネス、感染力価（IP / ml）および対応するVP / IP比を有することが確認されました。 HIVエピトープおよびHis 6タグの両方がAd5のキャプシドの表面に露出していた、と彼ら自身のエピトープ特異的抗原性を保持していました。中和アッセイは、 インビトロでのAd5陽性血清による中和を回避するために、この二価のベクターの能力を示しました。マウスの免疫は、HIVエピトープおよびHis 6に特有の強固な体液性免疫の生成を実証しました。この証明の原理研究は、抗原キャプシド取り込み戦略に関連するプロトコルを実行可能に異なるキャプシドタンパク質を修飾することにより、ベクトル化のAd5ワクチンの生成のために利用され得ることを示唆しました。このプロトコルは、さらにfとすることができましたurtherまれな血清型のアデノウイルスベクター化ワクチンの生成のために修正されました。

抗原キャプシド組み込み戦略（ 図1A）は 、二価のAd5ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-Hisの6を生成するために利用されました。まず、シャトルプラスミドHVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sは、以前の構築シャトルプラスミドHVR5-彼6 / pH5S 17にHVR1-KWAS断片をサブクローニングすることにより構築しました。第二に、プラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6 <...

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Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

ここでは、実証の原則二価のアデノウイルス5型（Ad5）ベクトルを生成するためのプロトコルを提示するAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6抗原キャプシド取り込み戦略を利用することによって。このベクターは、定性的フィットネス、Ad5の陽性in vitroでの血清、および抗原性ならびに組み込まれた抗原に対する免疫原性を脱出する能力を示すことが実証されました。

アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチの開発のための抗原キャプシド取り込み戦略を活用

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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